Herstellung von hochtiterinfektiösen Influenza-Pseudotyppartikeln mit Hülllykoproteinen aus hoch pathogenen H5N1- und Avian H7N9-Viren
Summary
Dieses Protokoll beschreibt einen experimentellen Prozess zur Herstellung hochtiter infektiöser viraler pseudotypisierter Partikel (pp) mit Hüllglykoproteinen aus zwei Influenza-A-Stämmen und wie ihre Infektiosität bestimmt werden kann. Dieses Protokoll ist sehr anpassungsfähig, um pps von jeder anderen Art von umhüllten Viren mit verschiedenen Hüll-Glykoproteinen zu entwickeln.
Abstract
Die gelegentliche direkte Übertragung des hoch pathogenen Aviären Influenza-A-Virus H5N1 (HPAI H5N1) und H7N9 auf den Menschen und ihre Letalität sind ernste Probleme der öffentlichen Gesundheit und deuten auf die Möglichkeit einer Epidemie hin. Unser molekulares Verständnis des Virus ist jedoch rudimentär, und es ist notwendig, die biologischen Eigenschaften seiner Hüllproteine als therapeutische Ziele zu untersuchen und Strategien zur Bekämpfung von Infektionen zu entwickeln. Wir entwickelten eine solide virale pseudotypisierte Partikel-(pp)-Plattform zur Untersuchung des Aviären Influenzavirus, einschließlich der funktionellen Analyse seiner Hemagglutinin (HA) und Neuraminidase (NA) Hüllproteine, die Neusortierungseigenschaften der HAs und NAs, Rezeptoren, Tropismen, neutralisierende Antikörper, Diagnose, Infektiosität, für die Zwecke der Arzneimittelentwicklung und Impfstoffentwicklung. Hier beschreiben wir ein experimentelles Verfahren zur Ermittlung von pps mit den Hüllproteinen (HA, NA) aus zwei Influenza-A-Stämmen (HAPI H5N1 und 2013 avian H7N9). Ihre Erzeugung basiert auf der Fähigkeit einiger Viren, wie dem murinen Leukämievirus (MLV), Hüllglykoproteine in ein pp zu integrieren. Darüber hinaus beschreiben wir auch, wie diese pps mit RT-qPCR quantifiziert werden, und die Infektiositätserkennung von nativen und nicht übereinstimmenden Virus-Pps, abhängig vom Ursprung der HAs und NAs. Dieses System ist hochflexibel und anpassungsfähig und kann verwendet werden, um virale pps mit Hüll-Glykoproteinen herzustellen, die in jede andere Art von umhüllten Viren eingearbeitet werden können. So kann diese virale Partikelplattform verwendet werden, um Wildviren in vielen Forschungsuntersuchungen zu untersuchen.
Introduction
Die Mission eines viralen Teilchens besteht darin, sein Genom von einer infizierten Wirtszelle in eine nicht infizierte Wirtszelle zu transportieren und in einer replikationskompetenten Form1in das Zytoplasma oder den Zellkern zu liefern. Dieser Prozess wird zunächst durch Bindung an Wirtzellrezeptoren ausgelöst, gefolgt von der Fusion von Virion und Zellmembranen. Für umhüllte Viren, wie Influenzaviren, sind die Spike-Glykoproteine für die Rezeptorbindung und Fusion1,2verantwortlich. Virale Hüllkinkoproteine (z.B. Pyrogene, Antigene) sind an vielen wichtigen Eigenschaften und Ereignissen beteiligt, wie z. B. Viruslebenszyklusinitiierung (Bindung und Fusion), virale Pathogenese, Immunogenität, Wirtszellapoptose und zellulärer Tropismus, der zelluläre endozytische Weg, sowie die Übertragung und Neusortierung zwischen Denspezies1,3,4,5,6,7. Die Forschung an viralen Hüllproteinen wird uns helfen, viele Aspekte des Virusinfektionsprozesses zu verstehen. Pseudotypisierte Viruspartikel (pp), auch Pseudovirions oder Pseudopartikel bezeichnet, können durch eine Pseudotypisierungstechnik8,9,10erzeugt werden. Diese Technologie wurde verwendet, um pseudotypisierte Partikel vieler Viren zu entwickeln, einschließlich Hepatitis C11,12, Hepatitis B13, vesikuläre Stomatitis Virus (VSV)14,15, und Influenza-Virus16,17,18,19. Diese Technologie basiert auf dem Gag-Pol-Protein von Lentiviren oder anderen Retroviren.
Pseudotypisierte Viruspartikel können mit einem Drei-Plasmid-System gewonnen werden, indem ein virales Hüllprotein-Expressionsplasmid, ein retrovirales Verpackungsplasmid, das das Hüllen-Env-Gen fehlt, und ein separates Reporter-Plasmid in pp-Produzentenzellen kotransfiziert werden. Das Retrovirus wird durch sein Gag-Protein zusammengesetzt, und es knospen aus einer infizierten Zellmembran, die das Virus Hülle Protein1ausdrückt. Daher ist es möglich, mit dem Retrovirus Gag-Protein mit hilfe des Retrovirus Gag-Proteins grippereiche Pnospen auf einer Zellmembran zu erhalten, die Influenza HA und NA exekliniert. In unseren früheren Studien waren HAs/NAs in allen Kombinationen funktional und in der Lage, ihre entsprechenden Funktionen im viralen Lebenszyklus16,17,18,20,21auszuführen. Diese pps werden verwendet, um biologische Influenza-Eigenschaften zu untersuchen, einschließlich Hämagglutination, Neuraminidase-Aktivität, HA-Rezeptor-Bindung Tropismus, und Infektiosität. Da HA und NA wichtige oberflächenfunktionelle Proteine im viralen Lebenszyklus sind, können nicht übereinstimmende HAs und NAs, die aus verschiedenen Grippestämmen abgeleitet sind, teilweise eine Neusortierung zwischen ihnen nachweisen. Hier erzeugen wir acht Arten von Influenza-Pps, indem wir zwei HAs und zwei NAs (abgeleitet vom HPAI H5N1-Stamm und dem H7N9-Fleck) mit einem Drei-Plasmid-Pseudotypisierungssystem kombinieren. Diese acht Arten von pps umfassen zwei native pps, H5N1pp, H7N9pp; zwei nicht übereinstimmende pps, (H5+N9)pp, (H7+N1)pp; und vier Pps, die nur ein einzelnes Glykoprotein (HA oder NA), H5pp, N1pp, H7pp, N9pp beherbergen. Studien zum Influenzavirus, wie H5N1 und H7N9, sind durch Biosicherheitsanforderungen begrenzt. Alle Untersuchungen der Wildinfluenza-Virusstämme sollten in einem Labor der Biosicherheitsstufe 3 (BSL-3) durchgeführt werden. Die pseudotypisierte virale Partikeltechnologie kann verwendet werden, um ein künstliches Virion in einer Biosicherheitsstufe 2 (BSL-2) zu verpacken. Daher stellen pps ein sichereres und nützliches Werkzeug dar, um die Influenza-Virusprozesse in Abhängigkeit von seinen beiden wichtigsten Glykoproteinen zu untersuchen: Hemagglutinin (HA) und Neuraminidase (NA).
Dieses Protokoll beschreibt die Generierung dieser pps mit einer Drei-Plasmid-Kotransfektionsstrategie (im Überblick in Abbildung 1), wie pps zu quantifizieren und Infektiositätsnachweis. Die pp-Produktion umfasst drei Arten von Plasmiden (Abbildung 1). Das Gag-Pol-Gen, das das Retrovirus Gag-Pol-Protein kodiert, wurde aus einem Retrovirus-Verpackungskit geklont und in das pcDNA 3.1-Plasmid eingeführt und mit dem Namen pcDNA-Gag-Pol aufgenommen. Das verbesserte Grüne fluoreszierende Protein (eGFP) Gen, das grünes Fluoreszenzprotein kodiert, wurde aus dem pTRE-EGFP-Vektor geklont, in das pcDNA 3.1-Plasmid eingeführt und als pcDNA-GFP bezeichnet. Beim Klonen wurde über eine Grundierung eine Verpackungssignalsequenz hinzugefügt. Die HA- und NA-Gene wurden in ein pVRC-Plasmid namens pVRC-HA bzw. pVRC-NA geklont. Das letzte Plasmid kodiert das Fusionsprotein und kann durch jedes andere Fusionsprotein von Interesse ersetzt werden. Unsere Pseudotypisierungsplattform umfasst zwei Glykoproteinexpressionsplasmide: pVRC-HA und pVRC-NA. Dies kann die Forschung zur Neusortierung zwischen verschiedenen Virusstämmen in einer BSL-2-Einstellung vereinfachen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Protokoll beschreiben wir eine Methode zur Herstellung von Pseudotyppartikeln (pp) des Influenzavirus in einer BSL-2-Einstellung. Das Reporter-Plasmid pcDNA-GFP ist in die pps integriert und kann verwendet werden, um pps von FACS in einem Infektiositätstest zu quantifizieren. Wir haben uns für zwei Arten von anfälligen Zelllinien entschieden, weil sie in der Grippeforschung weit verbreitet sind. MDCK-Zellen würden eine gute Kontrolle für die variablen verewigten menschlichen Zellen bieten, die in diesen St…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Stipendien von Zhejiang Provincial Medicine and Health Science and Technology Plan (Grant Numbers, 2017KY538), Hangzhou Municipal Medicine and Health Science and Technology Plan (Grant Numbers, OO20190070), Hangzhou Medical Science and Technologieschlüsselprojekt (Grant Numbers, 2014Z11) und Kommunales autonomes Anwendungsprojekt hangzhou für soziale Entwicklung und wissenschaftliche Forschung (Grant Numbers, 20191203B134).
Materials
| Benzonase Nuclease | Millipore | 70664 | Effective viscosity reduction and removal of nucleic acids from protein solutions |
| Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates (96-well) | Corning | 3599 | Treated for optimal cell attachment Sterilized by gamma radiation and certified nonpyrogenic Individual alphanumeric codes for well identification |
| Clear TC-treated Multiple Well Plates (6-wells) | Costar | 3516 | Individual alphanumerical codes for well identification Treated for optimal cell attachment Sterilized by gamma irradiation |
| Dulbecco's modified essential medium (DMEM) | Gibco | 11965092 | A widely used basal medium for supporting the growth of many different mammalian cells |
| Fetal bovine serum | Excell | FND500 | fetal bovine sera that can offer excellent value for basic cell culture, specialty research, and specific assays |
| Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) | Beckman coulter | cytoflex | |
| Human alveolar adenocarcinoma A549 cells | ATCC | CRM-CCL-185 | |
| Human embryonic kidney (HEK) HEK-293T/17 cells | ATCC | CRL-11268 | A versatile transfection reagent that has been shown to effectively transfect the widest variety of adherent and suspension cell lines |
| Inverted fluorescent biological microscope | Olympus | BX51-32P01-FLB3 | |
| Inverted light microscope | Olympus | CKX31-12PHP | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668019 | Rapid, sensitive and precise probe-based qPCR detection and quantitation of target RNA targets. |
| Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit | NEB | E3006L | Will withstand up to 14,000 RCF RNase-/DNase-free Nonpyrogenic |
| Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells | ATCC | CCL-34 | |
| MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube (1.5 mL) | Axygen | MCT-150-C | 33 mm, gamma sterilized |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF | Millipore | SLHV033RS | an improved Minimal Essential Medium (MEM) that allows for a reduction of Fetal Bovine Serum supplementation by at least 50% with no change in cell growth rate or morphology. Opti-MEM I medium is also recommended for use with cationic lipid transfection reagents, such as Lipofectamine reagent. |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 11058021 | The antibiotics penicillin and streptomycin are used to prevent bacterial contamination of cell cultures due to their effective combined action against gram-positive and gram-negative bacteria. |
| penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | Maximum RCF is 12,500 xg Temperature range from -80 °C to 120 °C RNase-/DNase-free Sterile |
| PP Centrifuge Tubes (15 mL) | Corning | 430791 | a stable and highly reactive serine protease |
| Proteinase K | Beyotime | ST532 | Treated for optimal cell attachment Sterilized by gamma radiation and certified nonpyrogenic |
| TC-treated Culture Dish (60mm) | Corning | 430166 | Trypsin from bovine pancreas TPCK Treated, essentially salt-free, lyophilized powder, ≥10,000 BAEE units/mg protein |
| TPCK-trypsin | Sigma | T1426 | This liquid formulation of trypsin contains EDTA and phenol red. Gibco Trypsin-EDTA is made from trypsin powder, an irradiated mixture of proteases derived from porcine pancreas. Due to its digestive strength, trypsin is widely used for cell dissociation, routine cell culture passaging, and primary tissue dissociation. The trypsin concentration required for dissociation varies with cell type and experimental requirements. |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 |
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