Production de particules pseudotypées de grippe infectieuse à haut régime avec des glycoprotéines d'enveloppe provenant de virus H5N1 hautement pathogènes et de virus H7N9 aviaires
Summary
Ce protocole décrit un processus expérimental pour produire des particules virales pseudotyped infectieuses à haut titre (pp) avec des glycoprotéines d’enveloppe de deux souches de grippe A et comment déterminer leur infectiosité. Ce protocole est très adaptable pour développer des pps de n’importe quel autre type de virus enveloppés avec différentes glycoprotéines d’enveloppe.
Abstract
La transmission directe occasionnelle du virus hautement pathogène de la grippe aviaire A H5N1 (HPAI H5N1) et du H7N9 aux humains et leur létalité sont de graves problèmes de santé publique et suggèrent la possibilité d’une épidémie. Cependant, notre compréhension moléculaire du virus est rudimentaire, et il est nécessaire d’étudier les propriétés biologiques de ses protéines enveloppe comme cibles thérapeutiques et de développer des stratégies pour contrôler l’infection. Nous avons développé une plate-forme solide de particules pseudotypées virales (pp) pour étudier le virus de la grippe aviaire, y compris l’analyse fonctionnelle de son enveloppe d’hémagglutinine (HA) et de neuraminidase (NA) glycoprotéines, les caractéristiques de réassortiment des HA et des NA, récepteurs, les tropismes, neutralisant les anticorps, le diagnostic, l’infectiosité, aux fins du développement de médicaments et de la conception de vaccins. Ici, nous décrivons une procédure expérimentale pour établir des pps avec les glycoprotéines d’enveloppe (HA, NA) de deux souches de grippe A (HAPI H5N1 et 2013 H7N9 aviaire). Leur génération est basée sur la capacité de certains virus, tels que le virus de la leucémie murine (MLV), d’incorporer des glycoprotéines enveloppe dans un pp. En outre, nous détaillons également comment ces pps sont quantifiés avec RT-qPCR, et la détection d’infectiosité des pps indigènes et inadaptés de virus selon l’origine des HAs et des NAs. Ce système est très flexible et adaptable et peut être utilisé pour établir des pps viraux avec des glycoprotéines enveloppe qui peuvent être incorporés dans n’importe quel autre type de virus enveloppé. Ainsi, cette plate-forme de particules virales peut être utilisée pour étudier les virus sauvages dans de nombreuses recherches.
Introduction
La mission d’une particule virale est de transporter son génome d’une cellule hôte infectée à une cellule hôte non infectée et de le livrer dans le cytoplasme ou le noyau sous une forme de réplication-compétente1. Ce processus est d’abord déclenché par la liaison aux récepteurs cellulaires hôtes, suivie par la fusion de virion et de membranes cellulaires. Pour les virus enveloppés, comme les virus grippaux, les glycoprotéines à pointe sont responsables de la liaison des récepteurs et de la fusion1,2. Les glycoprotéines d’enveloppe virale (par exemple, pyrogènes, antigènes), sont impliquées dans beaucoup de propriétés et d’événements importants, tels que l’initiation de cycle de vie de virus (liaison et fusion), la pathogénie virale, l’immunogénicité, l’apoptose de cellules d’hôte et le tropisme cellulaire, la voie endocytique cellulaire, aussi bien que la transmission et le reassortiment interspécifiques1,3,4,5,6,7. La recherche sur les glycoprotéines d’enveloppe virale nous aidera à comprendre beaucoup d’aspects du processus d’infection virale. Les particules virales pseudotypées (pp), aussi appelées pseudovirions ou pseudoparticules, peuvent être générées par une technique de pseudotypage8,9,10. Cette technologie a été utilisée pour développer des particules pseudotypées de nombreux virus, y compris l’hépatite C11,12, l’hépatite B13, virus de la stomatérite vésiculaire (VSV)14,15, et le virus de la grippe16,17,18,19. Cette technologie est basée sur la protéine Gag-Pol des lentivirus ou d’autres rétrovirus.
Les particules virales pseudotypées peuvent être obtenues à l’aide d’un système à trois plasmides en cotransfectant une enveloppe virale d’expression de glycoprotéine plasmide, un plasmide d’emballage rétroviral manquant le gène env d’enveloppe, et un plasmide de journaliste séparé dans les cellules de producteur pp. Le rétrovirus est assemblé par sa protéine Gag, et il bourgeonne à partir d’une membrane cellulaire infectée qui exprime la protéine enveloppe virale1. Par conséquent, il est possible d’obtenir des pps de grippe de haute titer utilisant la protéine de Gag rétrovirus pour produire des bourgeons sur une membrane cellulaire exprimant l’influenza HA et NA. Dans nos études précédentes, les H/NA dans toutes les combinaisons étaient fonctionnels et capables d’exécuter leurs fonctions correspondantes dans le cycle de vie viral16,17,18,20,21. Ces pps sont employés pour étudier des caractéristiques biologiques de grippe, y compris l’hémagglutination, l’activité de neuraminidase, le tropisme liant de HA-récepteur, et l’infectiosité. Étant donné que l’HA et l’AN sont deux protéines fonctionnelles de surface importantes dans le cycle de vie viral, les H et les NA dépareillés dérivés de différentes souches de la grippe peuvent en partie démontrer le réassortiment entre eux. Ici, nous produisons huit types de pps de grippe en combinant deux HAs et deux NA (dérivé de la souche H5N1 de HPAI et de la tache H7N9), utilisant un système de pseudotypage à trois plasmides. Ces huit types de pps comprennent deux pps indigènes, H5N1pp, H7N9pp; deux pps dépareillés, (H5-N9)pp, (H7-N1)pp; et quatre pps hébergeant seulement une seule glycoprotéine (HA ou NA), H5pp, N1pp, H7pp, N9pp. Les études sur le virus de l’influenza, telles que H5N1 et H7N9, sont limitées par des exigences de biosécurité. Toutes les études sur les souches du virus de l’influenza sauvage doivent être effectuées dans un laboratoire de biosécurité de niveau 3 (BSL-3). La technologie des particules virales pseudotypées peut être utilisée pour emballer une virion artificielle dans un cadre de niveau de biosécurité 2 (BSL-2). Par conséquent, les pps représentent un outil plus sûr et utile pour étudier les processus de virus de l’influenza en fonction de ses deux glycoprotéines principales : l’hémagglutinine (HA) et la neuraminidase (NA).
Ce protocole décrit la génération de ces pps avec une stratégie de cotransfection à trois plasmides (survu la figure 1),comment quantifier les pps, et la détection de l’infectiosité. La production pp implique trois types de plasmides (Figure 1). Le gène gag-pol, qui code la protéine rétrovirus Gag-Pol, a été cloné à partir d’un kit d’emballage rétrovirus et inséré dans le plasmide pcDNA 3.1 et nommé pcDNA-Gag-Pol. Le gène amélioré de protéine fluorescente verte (eGFP), qui code la protéine fluorescente verte, a été cloné du vecteur de pTRE-EGFP, inséré dans le plasmide de PCDNA 3.1, et appelé pcDNA-GFP. Pendant le clonage, une séquence de signal d’emballage a été ajoutée par l’intermédiaire d’une amorce. Les gènes HA et NA ont été clonés dans un plasmide pVRC, nommé pVRC-HA et pVRC-NA, respectivement. Le dernier plasmide code la protéine de fusion et peut être remplacé par n’importe quelle autre protéine de fusion d’intérêt. Notre plate-forme de pseudotypage comprend deux plasmides d’expression de glycoprotéine : pVRC-HA et pVRC-NA. Cela peut simplifier la recherche sur le réassortiment entre les différentes souches virales dans un cadre BSL-2.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans ce protocole, nous décrivons une méthode pour produire des particules pseudotypées de virus de grippe (pp) dans un arrangement de BSL-2. Le plasmique du plasmique pcDNA-GFP est incorporé dans les pps et peut être utilisé pour quantifier les pps par FACS dans un test d’infectiosité. Nous avons choisi deux types de lignées cellulaires sensibles parce qu’elles sont largement utilisées dans la recherche sur l’influenza. Les cellules MDCK fourniraient un bon contrôle aux cellules humaines immortalisées variabl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par des subventions du Zhejiang Provincial Medicine and Health Science and Technology Plan (Grant Numbers, 2017KY538), Hangzhou Municipal Medicine and Health Science and Technology Plan (Grant Numbers, OO20190070), Hangzhou Medical Science et Projet clé technologique (Grant Numbers, 2014Z11) et Projet municipal d’application autonome de Hangzhou de développement social et de recherche scientifique (Grant Numbers, 20191203B134).
Materials
| Benzonase Nuclease | Millipore | 70664 | Effective viscosity reduction and removal of nucleic acids from protein solutions |
| Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates (96-well) | Corning | 3599 | Treated for optimal cell attachment Sterilized by gamma radiation and certified nonpyrogenic Individual alphanumeric codes for well identification |
| Clear TC-treated Multiple Well Plates (6-wells) | Costar | 3516 | Individual alphanumerical codes for well identification Treated for optimal cell attachment Sterilized by gamma irradiation |
| Dulbecco's modified essential medium (DMEM) | Gibco | 11965092 | A widely used basal medium for supporting the growth of many different mammalian cells |
| Fetal bovine serum | Excell | FND500 | fetal bovine sera that can offer excellent value for basic cell culture, specialty research, and specific assays |
| Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) | Beckman coulter | cytoflex | |
| Human alveolar adenocarcinoma A549 cells | ATCC | CRM-CCL-185 | |
| Human embryonic kidney (HEK) HEK-293T/17 cells | ATCC | CRL-11268 | A versatile transfection reagent that has been shown to effectively transfect the widest variety of adherent and suspension cell lines |
| Inverted fluorescent biological microscope | Olympus | BX51-32P01-FLB3 | |
| Inverted light microscope | Olympus | CKX31-12PHP | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668019 | Rapid, sensitive and precise probe-based qPCR detection and quantitation of target RNA targets. |
| Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit | NEB | E3006L | Will withstand up to 14,000 RCF RNase-/DNase-free Nonpyrogenic |
| Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells | ATCC | CCL-34 | |
| MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube (1.5 mL) | Axygen | MCT-150-C | 33 mm, gamma sterilized |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF | Millipore | SLHV033RS | an improved Minimal Essential Medium (MEM) that allows for a reduction of Fetal Bovine Serum supplementation by at least 50% with no change in cell growth rate or morphology. Opti-MEM I medium is also recommended for use with cationic lipid transfection reagents, such as Lipofectamine reagent. |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 11058021 | The antibiotics penicillin and streptomycin are used to prevent bacterial contamination of cell cultures due to their effective combined action against gram-positive and gram-negative bacteria. |
| penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | Maximum RCF is 12,500 xg Temperature range from -80 °C to 120 °C RNase-/DNase-free Sterile |
| PP Centrifuge Tubes (15 mL) | Corning | 430791 | a stable and highly reactive serine protease |
| Proteinase K | Beyotime | ST532 | Treated for optimal cell attachment Sterilized by gamma radiation and certified nonpyrogenic |
| TC-treated Culture Dish (60mm) | Corning | 430166 | Trypsin from bovine pancreas TPCK Treated, essentially salt-free, lyophilized powder, ≥10,000 BAEE units/mg protein |
| TPCK-trypsin | Sigma | T1426 | This liquid formulation of trypsin contains EDTA and phenol red. Gibco Trypsin-EDTA is made from trypsin powder, an irradiated mixture of proteases derived from porcine pancreas. Due to its digestive strength, trypsin is widely used for cell dissociation, routine cell culture passaging, and primary tissue dissociation. The trypsin concentration required for dissociation varies with cell type and experimental requirements. |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 |
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