Productie van Hoogtiter infectieuze influenza pseudo-getypte deeltjes met envelop glycoproteïnen van hoogpathogene H5N1 en aviaire H7N9 virussen
Summary
Dit protocol beschrijft een experimenteel proces voor het produceren van hoogtiter infectieuze virale pseudo-getypte deeltjes (PP) met envelop glycoproteïnen uit twee influenza-A-stammen en hoe ze hun infectiviteit kunnen bepalen. Dit protocol is zeer aanpasbaar om PPS te ontwikkelen van elk ander type omhulde virussen met verschillende envelop glycoproteïnen.
Abstract
De occasionele rechtstreekse overdracht van het hoogpathogene aviaire influenza A-virus H5N1 (HPAI H5N1) en H7N9 op de mens en hun letaliteit zijn ernstige volksgezondheidsproblemen en suggereren de mogelijkheid van een epidemie. Echter, ons moleculair begrip van het virus is rudimentair, en het is noodzakelijk om de biologische eigenschappen van haar envelop eiwitten te bestuderen als therapeutische doelen en om strategieën te ontwikkelen om infectie te beheersen. We ontwikkelden een solide virale pseudo getypte deeltje (PP) om het aviaire-influenzavirus te bestuderen, met inbegrip van de functionele analyse van zijn hemagglutinine (HA) en neuraminidase (NA) envelop glycoproteïnen, de reassortimentkarakteristieken van de HAs en NAs, receptoren, tropismen, neutraliserende antilichamen, diagnose, infectiviteit, voor de toepassing van de ontwikkeling van geneesmiddelen en vaccin ontwerp. Hier beschrijven we een experimentele procedure om PPS vast te stellen met de envelop glycoproteïnen (HA, NA) van twee influenza A-stammen (HAPI H5N1 en 2013 Avian H7N9). Hun generatie is gebaseerd op de capaciteit van sommige virussen, zoals Murine leukemievirus (MLV), envelop glycoproteïnen in een PP opnemen. Daarnaast wordt ook gedetailleerd beschreven hoe deze PPS worden gekwantificeerd met RT-qPCR, en de infectiviteit detectie van native en niet-overeenkomende virus PPS, afhankelijk van de oorsprong van de HAs en NAs. Dit systeem is zeer flexibel en aanpasbaar en kan worden gebruikt voor het vaststellen van virale PPS met envelop glycoproteïnen die kunnen worden opgenomen in elk ander type omhuld virus. Dus, dit virale deeltjes platform kan worden gebruikt om wilde virussen te bestuderen in veel onderzoek onderzoeken.
Introduction
De missie van een virale deeltje is het vervoer van zijn genoom van een geïnfecteerde gastheer cel naar een niet-geïnfecteerde host cel en om het te leveren in het cytoplasma of de Nucleus in een replicatie-bevoegde vorm1. Dit proces wordt in eerste instantie veroorzaakt door binding aan host cel receptoren, gevolgd door fusie van virion en cellulaire membranen. Voor omhulde virussen, zoals influenzavirussen, zijn de Spike glycoproteïnen verantwoordelijk voor de receptor binding en Fusion1,2. Virale envelop glycoproteïnen (bijv. pyrogenen, antigenen), zijn betrokken bij veel belangrijke eigenschappen en gebeurtenissen, zoals initiatie van de virus levenscyclus (binding en fusie), virale pathogenese, immunogeniciteit, host Cell apoptosis en cellulaire tropisme, het cellulaire endocytische traject, evenals interspecifieke transmissie en reassortiment1,3,4,5,6,7. Onderzoek naar virale envelop glycoproteïnen zal ons helpen veel aspecten van het virale infectie proces te begrijpen. Pseudo-getypte virale deeltjes (PP), ook wel pseudo virionen of pseudopartikelen genoemd, kunnen worden gegenereerd door middel van een pseudo type techniek8,9,10. Deze technologie is gebruikt om pseudo-getypte deeltjes van veel virussen te ontwikkelen, waaronder hepatitis C11,12, hepatitis B13, vesiculaire stomatitis virus (VSV)14,15en influenzavirus16,17,18,19. Deze technologie is gebaseerd op het gag-Pol-eiwit van lentivirussen of andere retrovirussen.
Pseudo-getypte virale deeltjes kunnen worden verkregen met behulp van een drie-plasmide systeem door cotransfecting een virale envelop glycoproteïne expressie plasmide, een retrovirale verpakking plasmide ontbreekt het omhulsel env gen, en een afzonderlijke verslaggever plasmide in PP-producerende cellen. De retrovirus wordt geassembleerd door zijn gag eiwit, en het knoppen van een geïnfecteerde celmembraan dat de virus envelop eiwit1uitdrukt. Daarom is het mogelijk om hoge titer influenza PPS te verkrijgen met behulp van het retrovirus gag Protein om knoppen te produceren op een cellulair membraan dat influenza HA en NA uitdrukt. In onze vorige studies waren/NAs in alle combinaties functioneel en in staat om hun corresponderende functies uit te voeren in de virale levenscyclus16,17,18,20,21. Deze PPS worden gebruikt voor het onderzoeken van de influenza biologische kenmerken, met inbegrip van hemagglutinatie, neuraminidase activiteit, HA-receptor bindend tropisme, en infectiviteit. Omdat HA en NA beide belangrijke oppervlakte functionele eiwitten in de virale levenscyclus zijn, kan niet-overeenkomende heeft en NAs afgeleid van verschillende soorten influenza gedeeltelijk reassortiment tussen hen aantonen. Hier genereren we acht soorten influenza PPS door twee HAs en twee NAs (afgeleid van de HPAI H5N1-stam en de H7N9 Stain) te combineren met behulp van een drieplasmide pseudo type systeem. Deze acht soorten PPS omvatten twee eigen PPS, H5N1pp, H7N9pp; twee niet-overeenkomende PPS, (H5 + N9) pp, (H7 + N1) pp; en vier KKS die slechts één glycoproteïne (HA of NA), H5pp, N1pp, H7pp, N9pp. onderzoeken naar het influenzavirus, zoals H5N1 en H7N9, worden beperkt door de bioveiligheidsvereisten. Alle onderzoeken naar de stammen van het wild influenzavirus dienen te worden uitgevoerd in een bioveiligheidsniveau 3 (BSL-3) laboratorium. Pseudo-getypte virale deeltjes technologie kan worden gebruikt voor het verpakken van een kunstmatige virion in een bioveiligheid Level 2 (BSL-2)-instelling. Daarom vertegenwoordigen PPS een veiliger en nuttig hulpmiddel om de influenzavirus processen te bestuderen, afhankelijk van de twee belangrijkste glycoproteïnen: hemagglutinine (HA) en neuraminidase (NA).
Dit protocol beschrijft het genereren van deze PPS met een drie-plasmide cotransfection-strategie ( overzien in figuur 1), hoe PPS te kwantificeren, en infectiviteit detectie. De PP-productie omvat drie soorten plasmiden (Figuur 1). Het gag-Pol- gen, dat het retrovirus gag-Pol-eiwit codeert, werd gekloond uit een retrovirus pakkingsset en ingebracht in de pcdna 3,1 plasmide en benoemde Pcdna-gag-Pol. Het verbeterde groene fluorescerende eiwit (eGFP)-gen, dat groene fluorescerende eiwitten codeert, werd gekloond uit pTRE-EGFP-vector, ingebracht in het pcDNA 3,1 plasmide en riep pcDNA-GFP. Tijdens het klonen werd een sequentie van het verpakkings signaal (ψ) toegevoegd via een primer. De genen van HA en NA werden gekloond in een pVRC plasmide, respectievelijk pVRC-HA en pVRC-NA. De laatste plasmide codeert het fusie-eiwit en kan worden vervangen door elke andere fusie-eiwit van belang. Ons pseudo type-platform bevat twee glycoproteïne expressie plasmiden: pVRC-HA en pVRC-NA. Dit kan het onderzoek naar reassortiment tussen verschillende virusstammen in een BSL-2-instelling te vereenvoudigen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit protocol beschrijven we een methode om influenzavirus pseudo-getypte deeltjes (PP) in een BSL-2-instelling te produceren. De verslaggever plasmide pcDNA-GFP is opgenomen in de PPS en kan worden gebruikt om PPS te kwantificeren door FACS in een infectiviteit assay. We kozen voor twee soorten gevoelige cellijnen omdat ze op grote schaal worden gebruikt in influenza onderzoek. MDCK-cellen zouden een goede controle geven op de variabele vereeuwigd menselijke cellen die in deze studies worden gebruikt.
<p class="jo…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door subsidies van Zhejiang Provincial Medicine en Health Science and Technology Plan (subsidie nummers, 2017KY538), Hangzhou gemeentelijke geneeskunde en Gezondheidswetenschappen en technologie plan (Grant Numbers, OO20190070), Hangzhou Medical Science en Technologisch sleutel project (subsidie nummers, 2014Z11) en gemeentelijk autonome toepassings project van Hangzhou voor sociale ontwikkeling en wetenschappelijk onderzoek (subsidie nummers 20191203B134).
Materials
| Benzonase Nuclease | Millipore | 70664 | Effective viscosity reduction and removal of nucleic acids from protein solutions |
| Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates (96-well) | Corning | 3599 | Treated for optimal cell attachment Sterilized by gamma radiation and certified nonpyrogenic Individual alphanumeric codes for well identification |
| Clear TC-treated Multiple Well Plates (6-wells) | Costar | 3516 | Individual alphanumerical codes for well identification Treated for optimal cell attachment Sterilized by gamma irradiation |
| Dulbecco's modified essential medium (DMEM) | Gibco | 11965092 | A widely used basal medium for supporting the growth of many different mammalian cells |
| Fetal bovine serum | Excell | FND500 | fetal bovine sera that can offer excellent value for basic cell culture, specialty research, and specific assays |
| Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) | Beckman coulter | cytoflex | |
| Human alveolar adenocarcinoma A549 cells | ATCC | CRM-CCL-185 | |
| Human embryonic kidney (HEK) HEK-293T/17 cells | ATCC | CRL-11268 | A versatile transfection reagent that has been shown to effectively transfect the widest variety of adherent and suspension cell lines |
| Inverted fluorescent biological microscope | Olympus | BX51-32P01-FLB3 | |
| Inverted light microscope | Olympus | CKX31-12PHP | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668019 | Rapid, sensitive and precise probe-based qPCR detection and quantitation of target RNA targets. |
| Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit | NEB | E3006L | Will withstand up to 14,000 RCF RNase-/DNase-free Nonpyrogenic |
| Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells | ATCC | CCL-34 | |
| MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube (1.5 mL) | Axygen | MCT-150-C | 33 mm, gamma sterilized |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF | Millipore | SLHV033RS | an improved Minimal Essential Medium (MEM) that allows for a reduction of Fetal Bovine Serum supplementation by at least 50% with no change in cell growth rate or morphology. Opti-MEM I medium is also recommended for use with cationic lipid transfection reagents, such as Lipofectamine reagent. |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 11058021 | The antibiotics penicillin and streptomycin are used to prevent bacterial contamination of cell cultures due to their effective combined action against gram-positive and gram-negative bacteria. |
| penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | Maximum RCF is 12,500 xg Temperature range from -80 °C to 120 °C RNase-/DNase-free Sterile |
| PP Centrifuge Tubes (15 mL) | Corning | 430791 | a stable and highly reactive serine protease |
| Proteinase K | Beyotime | ST532 | Treated for optimal cell attachment Sterilized by gamma radiation and certified nonpyrogenic |
| TC-treated Culture Dish (60mm) | Corning | 430166 | Trypsin from bovine pancreas TPCK Treated, essentially salt-free, lyophilized powder, ≥10,000 BAEE units/mg protein |
| TPCK-trypsin | Sigma | T1426 | This liquid formulation of trypsin contains EDTA and phenol red. Gibco Trypsin-EDTA is made from trypsin powder, an irradiated mixture of proteases derived from porcine pancreas. Due to its digestive strength, trypsin is widely used for cell dissociation, routine cell culture passaging, and primary tissue dissociation. The trypsin concentration required for dissociation varies with cell type and experimental requirements. |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 |
References
- Knipe, D. M., Howley, P. M. . Fields Virology (6th). , (2013).
- White, J. M., Delos, S. E., Brecher, M., Schornberg, K. Structures and mechanisms of viral membrane fusion proteins: multiple variations on a common theme. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 43 (3), 189-219 (2008).
- Bright, R. A., et al. Cross-clade protective immune responses to influenza viruses with H5N1 HA and NA elicited by an influenza virus-like particle. PLoS One. 3 (1), 1501 (2008).
- Yang, J., et al. Reliability of pseudotyped influenza viral particles in neutralizing antibody detection. PLoS One. 9 (12), 113629 (2014).
- Wyatt, R., Sodroski, J. The HIV-1 envelope glycoproteins: fusogens, antigens, and immunogens. Science. 280 (5371), 1884-1888 (1998).
- Joe, A. K., Foo, H. H., Kleeman, L., Levine, B. The transmembrane domains of Sindbis virus envelope glycoproteins induce cell death. Journal of Virology. 72 (5), 3935-3943 (1998).
- Albecka, A., Laine, R. F., Janssen, A. F., Kaminski, C. F., Crump, C. M. HSV-1 Glycoproteins Are Delivered to Virus Assembly Sites Through Dynamin-Dependent Endocytosis. Traffic. 17 (1), 21-39 (2016).
- Huang, A. S., Palma, E. L., Hewlett, N., Roizman, B. Pseudotype formation between enveloped RNA and DNA viruses. Nature. 252 (5485), 743-745 (1974).
- Rubin, H. Genetic Control of Cellular Susceptibility to Pseudotypes of Rous Sarcoma Virus. Virology. 26, 270-276 (1965).
- Steffen, I., Simmons, G. Pseudotyping Viral Vectors With Emerging Virus Envelope Proteins. Current Gene Therapy. 16 (1), 47-55 (2016).
- Bartosch, B., Dubuisson, J., Cosset, F. L. Infectious hepatitis C virus pseudo-particles containing functional E1-E2 envelope protein complexes. Journal of Experimental Medicine. 197 (5), 633-642 (2003).
- Bian, T., Zhou, Y., Bi, S., Tan, W., Wang, Y. HCV envelope protein function is dependent on the peptides preceding the glycoproteins. Biochemical and Biophysical Research Communications. 378 (1), 118-122 (2009).
- Gudima, S., Meier, A., Dunbrack, R., Taylor, J., Bruss, V. Two potentially important elements of the hepatitis B virus large envelope protein are dispensable for the infectivity of hepatitis delta virus. Journal of Virology. 81 (8), 4343-4347 (2007).
- Yoshida, Y., Emi, N., Hamada, H. VSV-G-pseudotyped retroviral packaging through adenovirus-mediated inducible gene expression. Biochemical and Biophysical Research Communications. 232 (2), 379-382 (1997).
- Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., Yee, J. K. Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (17), 8033-8037 (1993).
- Zhang, F., et al. Characterization of pseudoparticles paired with hemagglutinin and neuraminidase from highly pathogenic H5N1 influenza and avian influenza A (H7N9) viruses. Virus Research. 253, 20-27 (2018).
- Zhang, F., et al. Infectivity of Pseudotyped Particles Pairing Hemagglutinin of Highly Pathogenic Avian Influenza a H5N1 Virus with Neuraminidases of The 2009 Pandemic H1N1 and a Seasonal H3N2. Journal of Bioterrorism & Biodefense. 2, 104 (2011).
- Wu, J., et al. Characterization of neuraminidases from the highly pathogenic avian H5N1 and 2009 pandemic H1N1 influenza A viruses. PLoS One. 5 (12), 15825 (2010).
- Nefkens, I., et al. Hemagglutinin pseudotyped lentiviral particles: characterization of a new method for avian H5N1 influenza sero-diagnosis. Journal of Clinical Virology. 39 (1), 27-33 (2007).
- Zhang, Y., et al. Hemagglutinin and neuraminidase matching patterns of two influenza A virus strains related to the 1918 and 2009 global pandemics. Biochemical and Biophysical Research Communications. 387 (2), 405-408 (2009).
- Lin, X., et al. Oseltamivir boosts 2009 H1N1 virus infectivity in vitro. Biochemical and Biophysical Research Communications. 390 (4), 1305-1308 (2009).
- McKay, T., Patel, M., Pickles, R. J., Johnson, L. G., Olsen, J. C. Influenza M2 envelope protein augments avian influenza hemagglutinin pseudotyping of lentiviral vectors. Gene Therapy. 13 (8), 715-724 (2006).
- Pan, H., et al. Autophagy mediates avian influenza H5N1 pseudotyped particle-induced lung inflammation through NF-kappaB and p38 MAPK signaling pathways. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (2), 183-195 (2014).
- Szecsi, J., et al. Induction of neutralising antibodies by virus-like particles harbouring surface proteins from highly pathogenic H5N1 and H7N1 influenza viruses. Virology Journal. 3, 70 (2006).
- Garcia, J. M., Lagarde, N., Ma, E. S., de Jong, M. D., Peiris, J. S. Optimization and evaluation of an influenza A (H5) pseudotyped lentiviral particle-based serological assay. Journal of Clinical Virology. 47 (1), 29-33 (2010).
- Garcia, J. M., Lai, J. C. Production of influenza pseudotyped lentiviral particles and their use in influenza research and diagnosis: an update. Expert Review of Anti-infective Therapy. 9 (4), 443-455 (2011).
- Haynes, J. R., et al. Influenza-pseudotyped Gag virus-like particle vaccines provide broad protection against highly pathogenic avian influenza challenge. Vaccine. 27 (4), 530-541 (2009).
- Schmeisser, F., et al. Production and characterization of mammalian virus-like particles from modified vaccinia virus Ankara vectors expressing influenza H5N1 hemagglutinin and neuraminidase. Vaccine. 30 (23), 3413-3422 (2012).
- Liu, Y. V., et al. Chimeric severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV) S glycoprotein and influenza matrix 1 efficiently form virus-like particles (VLPs) that protect mice against challenge with SARS-CoV. Vaccine. 29 (38), 6606-6613 (2011).
- Moeschler, S., Locher, S., Conzelmann, K. K., Kramer, B., Zimmer, G. Quantification of Lyssavirus-Neutralizing Antibodies Using Vesicular Stomatitis Virus Pseudotype Particles. Viruses. 8 (9), 254 (2016).
- Lai, A. L., Millet, J. K., Daniel, S., Freed, J. H., Whittaker, G. R. The SARS-CoV Fusion Peptide Forms an Extended Bipartite Fusion Platform that Perturbs Membrane Order in a Calcium-Dependent Manner. Journal of Molecular Biology. 429 (24), 3875-3892 (2017).
- Millet, J. K., et al. Middle East respiratory syndrome coronavirus infection is inhibited by griffithsin. Antiviral Research. 133, 1-8 (2016).
- Millet, J. K., et al. Production of Pseudotyped Particles to Study Highly Pathogenic Coronaviruses in a Biosafety Level 2 Setting. Journal of Visualized Experiments. (145), e59010 (2019).
- Ma, M., et al. Murine leukemia virus pseudotypes of La Crosse and Hantaan Bunyaviruses: a system for analysis of cell tropism. Virus Research. 64 (1), 23-32 (1999).
- Wool-Lewis, R. J., Bates, P. Characterization of Ebola virus entry by using pseudotyped viruses: identification of receptor-deficient cell lines. Journal of Virology. 72 (4), 3155-3160 (1998).
- Chen, C. M., et al. Production and design of more effective avian replication-incompetent retroviral vectors. Developmental Biology. 214 (2), 370-384 (1999).
- Kaku, Y., et al. Second generation of pseudotype-based serum neutralization assay for Nipah virus antibodies: sensitive and high-throughput analysis utilizing secreted alkaline phosphatase. Journal of Virological Methods. 179 (1), 226-232 (2012).
- Rudiger, D., Kupke, S. Y., Laske, T., Zmora, P., Reichl, U. Multiscale modeling of influenza A virus replication in cell cultures predicts infection dynamics for highly different infection conditions. PLOS Computational Biology. 15 (2), 1006819 (2019).
- Petiot, E., et al. Influenza viruses production: Evaluation of a novel avian cell line DuckCelt(R)-T17. Vaccine. 36 (22), 3101-3111 (2018).
