إنتاج جسيمات الإنفلونزا المعدية العالية التهابات بالمغلفات بالبروتينات السكرية المسببة للامراض الشديدة H5N1 وفيروسات الطيور H7N9
Summary
يصف هذا البروتوكول عمليه تجريبية لإنتاج الجسيمات الفيروسية المعدية عاليه التهاب (pp) مع البروتينات السكرية المغلفة من اثنين من سلالات الإنفلونزا A وكيفيه تحديد عدويها. هذا البروتوكول هو قابل للتكيف للغاية لتطوير pps من اي نوع آخر من الفيروسات يلفها مع البروتينات السكرية مغلف مختلفه.
Abstract
ومن المسائل الخطيرة المتعلقة بالصحة العامة الانتقال المباشر العرضي لإنفلونزا الطيور A المسببة للامراض الشديدة من فيروس H5N1 (HPAI H5N1) و H7N9 إلى البشر والفتك بها ، وتشير إلى احتمال حدوث وباء. ومع ذلك ، فان فهمنا الجزيئي للفيروس بدائي ، ومن الضروري دراسة الخواص البيولوجية للبروتينات المغلفة كاهداف علاجيه ووضع استراتيجيات للسيطرة علي العدوى. طورنا منصة الجسيمات الفيروسية الصلبة (pp) لدراسة فيروس إنفلونزا الطيور ، بما في ذلك التحليل الوظيفي للبروتينات السكرية المغلفة هيماغلوتينين (HA) والعصبية (NA) ، وخصائص أعاده التشكيل لل والناس ، مستقبلات, الانقسامات, تحييد الأجسام المضادة, التشخيص, عدوي, لأغراض تطوير المخدرات وتصميم اللقاح. هنا ، ونحن وصف اجراء تجريبي لإنشاء pps مع البروتينات السكرية المغلف (HA ، NA) من اثنين من سلالات الإنفلونزا A (HAPI H5N1 و 2013 الطيور H7N9). ويستند جيلهم علي قدره بعض الفيروسات ، مثل فيروس سرطان الدم murine (MLV) ، لدمج البروتينات السكرية المغلف في pp. الاضافه إلى ذلك ، ونحن أيضا بالتفصيل كيف يتم قياس هذه pps مع RT-qPCR ، والكشف عن عدوي الفيروس الأصلي وغير متطابقة pps اعتمادا علي أصل وقد و NAs. هذا النظام هو مرنه للغاية وقابله للتكيف ويمكن استخدامها لإنشاء pps الفيروسية مع البروتينات السكرية المغلف التي يمكن ادراجها في اي نوع آخر من الفيروسات يلفها. وهكذا ، يمكن استخدام هذه المنصة الجسيمات الفيروسية لدراسة الفيروسات البرية في العديد من التحقيقات البحثية.
Introduction
وتتمثل مهمة الجسيمات الفيروسية في نقل المجين البشري من خليه مضيفه مصابه إلى خليه مضيفه غير مصابه وتسليمه إلى الخلايا الخلوية أو النواة في شكل النسخ المتماثل المختص1. يتم تشغيل هذه العملية في البداية عن طريق ربط مستقبلات الخلايا المضيفة ، تليها الانصهار من الاغشيه الخلوية والخلايا. للفيروسات المغلفة ، مثل فيروسات الإنفلونزا ، البروتينات السكرية الحاده هي المسؤولة عن مستقبلات ملزمه والانصهار1،2. الفيروسية المغلف البروتينات السكرية (علي سبيل المثال ، الحمم البركانية ، المستضدات) ، وتشارك في العديد من الخصائص والاحداث الهامه ، مثل بدء دوره حياه الفيروسات (ملزمه والانصهار) ، والمرض الفيروسي ، والاستمناع ،والخلية المضيفة المبرمج والتروسيه الخلوية ، ومسار البحوث علي البروتينات السكرية المغلف الفيروسية سوف تساعدنا علي فهم العديد من جوانب عمليه العدوى الفيروسية. الجسيمات الفيروسية الكاذبة (pp) ، وتسمي أيضا سودوفيريونز أو الكاذبة ، يمكن ان تتولد من خلال تقنيه التنميط الكاذب8،9،10. وقد استخدمت هذه التكنولوجيا لتطوير الجزيئات الكاذبة من العديد من الفيروسات, بما في ذلك التهاب الكبد C11,12, التهاب الكبد ب13, فيروس التهاب الفم الحويصلي (vsv)14,15, وفيروس الإنفلونزا16,17,18,19. وتستند هذه التكنولوجيا علي البروتين هفوة بول من لينتيفيروسيس أو غيرها من الفيروسات الرجعية.
يمكن الحصول علي الجزيئات الفيروسية الكاذبة باستخدام نظام البلازما الثلاثة عن طريق التحويل الفيروسي لغلاف البروتين السكري البلازميد ، والعبوات المضادة للفيروسات الارتجاعية في عداد المفقودين الجينات المغلف البيئية ، ومراسل منفصل البلازميد في الخلايا المنتجة pp. يتم تجميع الفيروس الرجعي من قبل بروتين الكمامة ، وانها براعم من غشاء الخلية المصابة التي تعبر عن بروتين مغلف الفيروس1. ولذلك ، فمن الممكن الحصول علي الإنفلونزا العالية عيار pps باستخدام الفيروس الرجعي الكمامة البروتين لإنتاج براعم علي الغشاء الخلوي التعبير عن الإنفلونزا HA و NA. في دراساتنا السابقة ، وقد/NAs في جميع تركيبات وظيفية وقادره علي أداء وظائفها المقابلة في دوره الحياة الفيروسية16،17،18،20،21. وتستخدم هذه الورقة للتحقيق في الخصائص البيولوجية الإنفلونزا, بما في ذلك التراص, النشاط نيوامينيداز, [ها-مستقبلات ملزمه التروسم, و عدوي. لان HA و NA علي حد سواء البروتينات الوظيفية السطحية الهامه في دوره الحياة الفيروسية ، وقد غير متطابقة و NAs المستمدة من سلالات مختلفه من الإنفلونزا يمكن ان تظهر جزئيا أعاده تشكيل بينهما. هنا ، ونحن توليد ثمانيه أنواع من الإنفلونزا pps من خلال الجمع بين اثنين واثنين من الناس (المستمدة من سلاله اتش بي جي 5 ووصمه العار H7N9) ، وذلك باستخدام نظام التنميط الكاذب ثلاثه plasmid. وتشمل هذه الأنواع الثمانية من pps اثنين الأصلي pps, H5N1pp, H7N9pp; اثنين غير متطابقة pps ، (H5 + N9) pp ، (H7 + N1) pp ؛ وأربعه pps فقط إيواء بروتين سكري واحد (HA أو NA) ، H5pp ، N1pp ، H7pp ، N9pp. والدراسات المتعلقة بفيروس الإنفلونزا ، مثل H5N1 و H7N9 ، محدوده بمتطلبات السلامة الاحيائيه. وينبغي اجراء جميع الدراسات المتعلقة بسلالات فيروس الإنفلونزا البرية في مختبر من مستوي السلامة البيولوجية 3 (BSL-3). ويمكن استخدام تكنولوجيا الجسيمات الفيروسية الزائفة لحزم الفيريون الاصطناعية في الاعداد 2 (BSL-2) مستوي السلامة الاحيائيه. ولذلك ، يمثل pps أداه أكثر أمانا وفائدة لدراسة عمليات فيروس الإنفلونزا اعتمادا علي اثنين من البروتينات السكرية الرئيسية: هيماغلوتينين (HA) و نيوامينيداز (NA).
يصف هذا البروتوكول الجيل من هذه pps مع استراتيجية ثلاثه plasmid المختلط (عرضت في الشكل 1) ، وكيفيه قياس pps ، والكشف عن عدوي. وينطوي إنتاج البولي بروبيلين علي ثلاثه أنواع من البلازميدات (الشكل 1). وقد استنسخت الجينات هفوة-pol ، والتي ترميز الفيروس الرجعية هفوة-بول البروتين ، من مجموعه التعبئة والتغليف الرجعية وادراجها في pcdna 3.1 بلازميد واسمه Pcdna-هفوة-pol. تم استنساخ الجين المعزز للبروتين الفلوري الأخضر (eGFP) ، الذي يشفر البروتين الفلوري الأخضر ، من ناقلات pTRE-EGFP ، والذي تم ادراجه في pcDNA 3.1 plasmid ، ودعا pcDNA-GFP. اثناء الاستنساخ ، تم أضافه تسلسل اشاره التعبئة والتغليف (ψ) عن طريق التمهيدي. تم استنساخ الجينات HA و NA في plasmid pVRC ، المسمي pVRC-HA و pVRC-NA ، علي التوالي. البلازما الاخيره بترميز البروتين الانصهار ويمكن استبدالها مع اي بروتين الانصهار الأخرى من الفائدة. لدينا منصة التنميط الكاذب ويشمل اثنين من التعبير البلازميدات بروتين سكري: pVRC-HA و pVRC-NA. وهذا يمكن تبسيط البحث علي أعاده تشكيل بين سلالات الفيروسات المختلفة في اعداد BSL-2.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذا البروتوكول ، ونحن وصف طريقه لإنتاج الجسيمات الكاذبة فيروس الإنفلونزا (pp) في اعداد BSL-2. وأدرجت المخبر البلازميد pcdna-gfp في pps ويمكن استخدامها لقياس pps من قبل facs في عدوي مقايسة. اخترنا نوعين من خطوط الخلايا الحساسة لأنها تستخدم علي نطاق واسع في أبحاث الإنفلونزا. ومن شان خلايا MDCK ان توفر سي?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد حظي هذا العمل بدعم من المنح المقدمة من الطب والعلوم الصحية وخطه التكنولوجيا في مقاطعه تشجيانغ (أرقام المنح ، 2017KY538) ، والطب البلدي في هانغتشو ، وخطه العلوم الصحية والتكنولوجيا (أرقام المنح ، OO20190070) ، والعلوم الطبية في هانغتشو التكنولوجيا الرئيسية المشروع (أرقام المنح ، 2014Z11) والبلدية هانغتشو مشروع التطبيق المستقل للتنمية الاجتماعية والبحث العلمي (أرقام المنح ، 20191203B134).
Materials
| Benzonase Nuclease | Millipore | 70664 | Effective viscosity reduction and removal of nucleic acids from protein solutions |
| Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates (96-well) | Corning | 3599 | Treated for optimal cell attachment Sterilized by gamma radiation and certified nonpyrogenic Individual alphanumeric codes for well identification |
| Clear TC-treated Multiple Well Plates (6-wells) | Costar | 3516 | Individual alphanumerical codes for well identification Treated for optimal cell attachment Sterilized by gamma irradiation |
| Dulbecco's modified essential medium (DMEM) | Gibco | 11965092 | A widely used basal medium for supporting the growth of many different mammalian cells |
| Fetal bovine serum | Excell | FND500 | fetal bovine sera that can offer excellent value for basic cell culture, specialty research, and specific assays |
| Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) | Beckman coulter | cytoflex | |
| Human alveolar adenocarcinoma A549 cells | ATCC | CRM-CCL-185 | |
| Human embryonic kidney (HEK) HEK-293T/17 cells | ATCC | CRL-11268 | A versatile transfection reagent that has been shown to effectively transfect the widest variety of adherent and suspension cell lines |
| Inverted fluorescent biological microscope | Olympus | BX51-32P01-FLB3 | |
| Inverted light microscope | Olympus | CKX31-12PHP | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668019 | Rapid, sensitive and precise probe-based qPCR detection and quantitation of target RNA targets. |
| Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit | NEB | E3006L | Will withstand up to 14,000 RCF RNase-/DNase-free Nonpyrogenic |
| Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells | ATCC | CCL-34 | |
| MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube (1.5 mL) | Axygen | MCT-150-C | 33 mm, gamma sterilized |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF | Millipore | SLHV033RS | an improved Minimal Essential Medium (MEM) that allows for a reduction of Fetal Bovine Serum supplementation by at least 50% with no change in cell growth rate or morphology. Opti-MEM I medium is also recommended for use with cationic lipid transfection reagents, such as Lipofectamine reagent. |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 11058021 | The antibiotics penicillin and streptomycin are used to prevent bacterial contamination of cell cultures due to their effective combined action against gram-positive and gram-negative bacteria. |
| penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | Maximum RCF is 12,500 xg Temperature range from -80 °C to 120 °C RNase-/DNase-free Sterile |
| PP Centrifuge Tubes (15 mL) | Corning | 430791 | a stable and highly reactive serine protease |
| Proteinase K | Beyotime | ST532 | Treated for optimal cell attachment Sterilized by gamma radiation and certified nonpyrogenic |
| TC-treated Culture Dish (60mm) | Corning | 430166 | Trypsin from bovine pancreas TPCK Treated, essentially salt-free, lyophilized powder, ≥10,000 BAEE units/mg protein |
| TPCK-trypsin | Sigma | T1426 | This liquid formulation of trypsin contains EDTA and phenol red. Gibco Trypsin-EDTA is made from trypsin powder, an irradiated mixture of proteases derived from porcine pancreas. Due to its digestive strength, trypsin is widely used for cell dissociation, routine cell culture passaging, and primary tissue dissociation. The trypsin concentration required for dissociation varies with cell type and experimental requirements. |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 |
References
- Knipe, D. M., Howley, P. M. . Fields Virology (6th). , (2013).
- White, J. M., Delos, S. E., Brecher, M., Schornberg, K. Structures and mechanisms of viral membrane fusion proteins: multiple variations on a common theme. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 43 (3), 189-219 (2008).
- Bright, R. A., et al. Cross-clade protective immune responses to influenza viruses with H5N1 HA and NA elicited by an influenza virus-like particle. PLoS One. 3 (1), 1501 (2008).
- Yang, J., et al. Reliability of pseudotyped influenza viral particles in neutralizing antibody detection. PLoS One. 9 (12), 113629 (2014).
- Wyatt, R., Sodroski, J. The HIV-1 envelope glycoproteins: fusogens, antigens, and immunogens. Science. 280 (5371), 1884-1888 (1998).
- Joe, A. K., Foo, H. H., Kleeman, L., Levine, B. The transmembrane domains of Sindbis virus envelope glycoproteins induce cell death. Journal of Virology. 72 (5), 3935-3943 (1998).
- Albecka, A., Laine, R. F., Janssen, A. F., Kaminski, C. F., Crump, C. M. HSV-1 Glycoproteins Are Delivered to Virus Assembly Sites Through Dynamin-Dependent Endocytosis. Traffic. 17 (1), 21-39 (2016).
- Huang, A. S., Palma, E. L., Hewlett, N., Roizman, B. Pseudotype formation between enveloped RNA and DNA viruses. Nature. 252 (5485), 743-745 (1974).
- Rubin, H. Genetic Control of Cellular Susceptibility to Pseudotypes of Rous Sarcoma Virus. Virology. 26, 270-276 (1965).
- Steffen, I., Simmons, G. Pseudotyping Viral Vectors With Emerging Virus Envelope Proteins. Current Gene Therapy. 16 (1), 47-55 (2016).
- Bartosch, B., Dubuisson, J., Cosset, F. L. Infectious hepatitis C virus pseudo-particles containing functional E1-E2 envelope protein complexes. Journal of Experimental Medicine. 197 (5), 633-642 (2003).
- Bian, T., Zhou, Y., Bi, S., Tan, W., Wang, Y. HCV envelope protein function is dependent on the peptides preceding the glycoproteins. Biochemical and Biophysical Research Communications. 378 (1), 118-122 (2009).
- Gudima, S., Meier, A., Dunbrack, R., Taylor, J., Bruss, V. Two potentially important elements of the hepatitis B virus large envelope protein are dispensable for the infectivity of hepatitis delta virus. Journal of Virology. 81 (8), 4343-4347 (2007).
- Yoshida, Y., Emi, N., Hamada, H. VSV-G-pseudotyped retroviral packaging through adenovirus-mediated inducible gene expression. Biochemical and Biophysical Research Communications. 232 (2), 379-382 (1997).
- Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., Yee, J. K. Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (17), 8033-8037 (1993).
- Zhang, F., et al. Characterization of pseudoparticles paired with hemagglutinin and neuraminidase from highly pathogenic H5N1 influenza and avian influenza A (H7N9) viruses. Virus Research. 253, 20-27 (2018).
- Zhang, F., et al. Infectivity of Pseudotyped Particles Pairing Hemagglutinin of Highly Pathogenic Avian Influenza a H5N1 Virus with Neuraminidases of The 2009 Pandemic H1N1 and a Seasonal H3N2. Journal of Bioterrorism & Biodefense. 2, 104 (2011).
- Wu, J., et al. Characterization of neuraminidases from the highly pathogenic avian H5N1 and 2009 pandemic H1N1 influenza A viruses. PLoS One. 5 (12), 15825 (2010).
- Nefkens, I., et al. Hemagglutinin pseudotyped lentiviral particles: characterization of a new method for avian H5N1 influenza sero-diagnosis. Journal of Clinical Virology. 39 (1), 27-33 (2007).
- Zhang, Y., et al. Hemagglutinin and neuraminidase matching patterns of two influenza A virus strains related to the 1918 and 2009 global pandemics. Biochemical and Biophysical Research Communications. 387 (2), 405-408 (2009).
- Lin, X., et al. Oseltamivir boosts 2009 H1N1 virus infectivity in vitro. Biochemical and Biophysical Research Communications. 390 (4), 1305-1308 (2009).
- McKay, T., Patel, M., Pickles, R. J., Johnson, L. G., Olsen, J. C. Influenza M2 envelope protein augments avian influenza hemagglutinin pseudotyping of lentiviral vectors. Gene Therapy. 13 (8), 715-724 (2006).
- Pan, H., et al. Autophagy mediates avian influenza H5N1 pseudotyped particle-induced lung inflammation through NF-kappaB and p38 MAPK signaling pathways. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (2), 183-195 (2014).
- Szecsi, J., et al. Induction of neutralising antibodies by virus-like particles harbouring surface proteins from highly pathogenic H5N1 and H7N1 influenza viruses. Virology Journal. 3, 70 (2006).
- Garcia, J. M., Lagarde, N., Ma, E. S., de Jong, M. D., Peiris, J. S. Optimization and evaluation of an influenza A (H5) pseudotyped lentiviral particle-based serological assay. Journal of Clinical Virology. 47 (1), 29-33 (2010).
- Garcia, J. M., Lai, J. C. Production of influenza pseudotyped lentiviral particles and their use in influenza research and diagnosis: an update. Expert Review of Anti-infective Therapy. 9 (4), 443-455 (2011).
- Haynes, J. R., et al. Influenza-pseudotyped Gag virus-like particle vaccines provide broad protection against highly pathogenic avian influenza challenge. Vaccine. 27 (4), 530-541 (2009).
- Schmeisser, F., et al. Production and characterization of mammalian virus-like particles from modified vaccinia virus Ankara vectors expressing influenza H5N1 hemagglutinin and neuraminidase. Vaccine. 30 (23), 3413-3422 (2012).
- Liu, Y. V., et al. Chimeric severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV) S glycoprotein and influenza matrix 1 efficiently form virus-like particles (VLPs) that protect mice against challenge with SARS-CoV. Vaccine. 29 (38), 6606-6613 (2011).
- Moeschler, S., Locher, S., Conzelmann, K. K., Kramer, B., Zimmer, G. Quantification of Lyssavirus-Neutralizing Antibodies Using Vesicular Stomatitis Virus Pseudotype Particles. Viruses. 8 (9), 254 (2016).
- Lai, A. L., Millet, J. K., Daniel, S., Freed, J. H., Whittaker, G. R. The SARS-CoV Fusion Peptide Forms an Extended Bipartite Fusion Platform that Perturbs Membrane Order in a Calcium-Dependent Manner. Journal of Molecular Biology. 429 (24), 3875-3892 (2017).
- Millet, J. K., et al. Middle East respiratory syndrome coronavirus infection is inhibited by griffithsin. Antiviral Research. 133, 1-8 (2016).
- Millet, J. K., et al. Production of Pseudotyped Particles to Study Highly Pathogenic Coronaviruses in a Biosafety Level 2 Setting. Journal of Visualized Experiments. (145), e59010 (2019).
- Ma, M., et al. Murine leukemia virus pseudotypes of La Crosse and Hantaan Bunyaviruses: a system for analysis of cell tropism. Virus Research. 64 (1), 23-32 (1999).
- Wool-Lewis, R. J., Bates, P. Characterization of Ebola virus entry by using pseudotyped viruses: identification of receptor-deficient cell lines. Journal of Virology. 72 (4), 3155-3160 (1998).
- Chen, C. M., et al. Production and design of more effective avian replication-incompetent retroviral vectors. Developmental Biology. 214 (2), 370-384 (1999).
- Kaku, Y., et al. Second generation of pseudotype-based serum neutralization assay for Nipah virus antibodies: sensitive and high-throughput analysis utilizing secreted alkaline phosphatase. Journal of Virological Methods. 179 (1), 226-232 (2012).
- Rudiger, D., Kupke, S. Y., Laske, T., Zmora, P., Reichl, U. Multiscale modeling of influenza A virus replication in cell cultures predicts infection dynamics for highly different infection conditions. PLOS Computational Biology. 15 (2), 1006819 (2019).
- Petiot, E., et al. Influenza viruses production: Evaluation of a novel avian cell line DuckCelt(R)-T17. Vaccine. 36 (22), 3101-3111 (2018).
