Индукция эриптоза в клетках красных кровяных клеток с использованием ионофора кальция

Запрограммированная гибель клеток в эритроцитах, также известных как эриптоз, распространена во многих клинических условиях и гематологических расстройствах. Eryptosis связано с усадкой клеток и потерей фосфолипидной асимметрии в мембране плазмы клетки^1,2. Потеря асимметрии приводит к транслокации фосфатидилсерина (PS), липида, обычно локализуемого во внутренней листовке^3,4, к клеточной внешней листовке, которая сигнализирует макрофагам на фагоциты и удаляет дефектные эритроциты^5,6,7,8. В конце нормальной продолжительности жизни эритроцитов удаление эриптотических клеток макрофагами обеспечивает баланс эритроцитов в обращении. Однако, в болезненных условиях, таких как серповидно-клеточная болезнь и талассемия^9,10,11, повышенный эриптоз может привести к тяжелой анемии². Из-за его важности в гематологических заболеваний, существует значительный интерес к изучению факторов, вызывающих или ингибирующих эриптоб и молекулярных механизмов, лежащих в основе этого процесса.

Плазменная мембрана здоровых эритроцитов асимметрична, с различными фосфолипидами, локализующихся на наружных и внутренних листовках. Мембранная асимметрия в первую очередь регулируется действием мембранных ферментов. Аминофосфолипид транслокс облегчает транспортировку аминофосфолипидов, PS и фосфатидиэтаноламин (ПЭ), направляя эти липиды на клеточной внутренней листовке. С другой стороны, флоппас транспортирует холин, содержащий фосфолипиды, фосфатидилхолин (ПК) и сфингомиелин (СМ), от внутренней к внешней листовке клеточной мембраны¹². Однако, в отличие от здоровых клеток, мембрана эритроцитов скремблируется. Это связано с действием третьего фермента, скремблаза, который нарушает фосфолипидную асимметрию, облегчая двунаправленный перенос аминофосфолипидов^13,14,15,16. Scramblase активируется повышенными внутриклеточными уровнями Ca^{2 .} Таким образом, ионофоры кальция, которые облегчают транспортировку Ca^{2 “через} клеточную мембрану¹², являются эффективными индукторами эриптоса.

Иономицин, ионофор кальция, широко используется для индуцирования эриптоза в эритроцитах^{12,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26}. Иономицин имеет как гидрофильные, так и гидрофобные группы, которые необходимы для связывания и захвата иона Ca^{2 и} транспортировать его в цитозолическое пространство^27,28,29. Это приводит к активации скремблаза и транслокации PS на внешнюю листовку, которая может быть легко обнаружена с помощью приложения-V, клеточного белка с высоким сродством к PS¹². Хотя запуск эриптоза иомамицином обычно сообщается, есть значительное расхождение метода в литературе (Таблица 1). Популяция эритроцитов, проходящих эриптоз, зависит от различных факторов, таких как концентрация ионофора, время лечения ионофором, а также содержание сахара в внеклеточной среде (истощение глюкозы активирует каналы катионов и облегчает вхождение Ca^{2 в} цитозоликическое пространство)^30,31. Тем не менее, есть мало последовательности в этих факторов в литературе, что затрудняет выполнение эриптоза воспроизводимо in vitro.

В этом протоколе мы представляем пошаговую процедуру, чтобы вызвать эритроциты человека. Учитываются факторы, влияющие на успешный эрипток, включая концентрацию Ca^2, концентрацию ионофора, время лечения и предварительное инкубацию в глюкозно-обеденный буфер и сообщается об оптимальных значениях. Эта процедура показывает, что прединкубация эритроцитов в буфере без глюкозы значительно увеличивает процент эриптоза по сравнению с глюкозосодержащим буфером. Этот протокол может быть использован в лаборатории для производства эриптотических эритроцитов для различных применений.