Summary

Indução de eryptose em glóbulos vermelhos usando um ionóforo de cálcio

Published: January 21, 2020
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Summary

Um protocolo para a indução da eritupse, a morte celular programada em eritrócitos, usando o ionóforo de cálcio, ionomicina, é fornecido. A eittose bem-sucedida é avaliada monitorando a fosfateina da localização no folheto exterior da membrana. Foram examinados fatores que afetam o sucesso do protocolo e condições ideais fornecidas.

Abstract

Eritrose, morte celular programada de eritrócito, ocorre em uma série de doenças hematológicas e durante a lesão aos eritrócitos. Uma marca registrada das células eryptoticas é a perda da assimetria composicional da membrana celular, levando à translocação de fósforoarfrino para o folheto externo da membrana. Este processo é desencadeado pelo aumento da concentração intracelular de Ca2+, que ativa a scramblase, uma enzima que facilita o movimento bidirecional de fosfolípidos entre folhetos de membrana. Dada a importância da eryptose em várias condições doentes, tem havido esforços para induzir a erytose in vitro. Tais esforços têm geralmente invocado o ionóforo de cálcio, ionomicina, para melhorar a concentração intracelular Ca2 + e induzir a eryptose. Entretanto, muitas discrepâncias foram relatadas na literatura a respeito do procedimento para induzir a eryptose usando o ionomycin. Aqui, relatamos um protocolo passo a passo para eritptose induzida pela ionomicina em eritrócitos humanos. Nós nos concentramos em etapas importantes no procedimento, incluindo a concentração de ionóforo, tempo de incubação e esgotamento da glicose, e fornecer resultado representativo. Este protocolo pode ser usado para induzir reproduzivelmente a eryptose em laboratório.

Introduction

A morte celular programada em eritrócitos, também conhecida como eritrose, é comum em muitas condições clínicas e distúrbios hematológicos. A eryptose está associada ao encolhimento celular e à perda de assimetria fosfolípida na membrana plasmática celular1,2. A perda de assimetria resulta na translocação de fosfatidylserine (PS), um lipídio normalmente localizado no folheto interno3,4, para o folheto exterior celular, que sinaliza para macrófagos para phagocitose e remover eritrócitos defeituosos5,6,7,8. No final da vida útil normal dos eritrócitos, a remoção de células eritptoticas por macrófagos garante o equilíbrio dos eritrócitos em circulação. No entanto, em condições doentes, como doença falciforme e talassemia9,10,11,eritrese reforçada pode resultar em anemia grave2. Devido à sua importância em doenças hematológicas, há um interesse significativo em examinar os fatores que induzem ou inibem a eryptose e os mecanismos moleculares subjacentes a este processo.

A membrana plasmática de eritrócitos saudáveis é assimétrica, com diferentes fosfolípidos localizando-se nos folhetos externos e internos. A assimetria da membrana é regulada principalmente pela ação das enzimas da membrana. O translocase aminofosfosfórico facilita o transporte de aminofosfípidos, PS e fosfatidylethanolamina (PE), direcionando esses lipídios para o folheto interno celular. Por outro lado, o floppase transporta a colina contendo fosfolípidos, fosfatatidylcholine (PC) e esfingomielina (SM), do interior ao folheto externo da membrana celular12. No entanto, ao contrário das células saudáveis, a membrana dos eritrócitos eritptoticos é embaralhada. Isto é devido à ação de uma terceira enzima, scramblase, que interrompe a assimetria fosfolípido, facilitando o transporte bidirecional de aminofosfosfípidos13,14,15,16. Scramblase é ativado por níveis intracelulares elevados de Ca2+. Portanto, os ionóforos de cálcio, que facilitam o transporte de Ca2+ através da membrana celular12,são indutores eficientes de eitosse.

Ionomicina, um ionóforo de cálcio, tem sido amplamente utilizado para induzir erittose em eritrócitos12,17,18,19,20,22,23,24,25,26. Ionomicina tem grupos hidrofílicos e hidrofóbicos, que são necessários para ligar e capturar íon Ca2 +, e transportá-lo para o espaço citosólico27,28,29. Isso leva à ativação de scramblase e translocação de PS para o folheto externo, que pode ser facilmente detectado usando annexin-V, uma proteína celular com uma alta afinidade com PS12. Embora provocar a eryptose por ionomicina seja relatado geralmente, há uma discrepância considerável do método na literatura(tabela 1). A população de eritrócitos submetidos à eritrose depende de diferentes fatores, como concentração de ionóforo, tempo de tratamento com ionóforo e o teor de açúcar do ambiente extracelular (esgotamento da glicose ativa canais de caation e facilita a entrada de Ca2+ no espaço citosólico)30,31. No entanto, há pouca consistência nesses fatores na literatura, dificultando o desempenho da eritose reproduzivelmente in vitro.

Neste protocolo, apresentamos um procedimento passo a passo para induzir eritrose em eritrócitos humanos. Os fatores que afetam a eryptose bem-sucedida que inclui a concentração de Ca2+, concentração do ionophore, tempo do tratamento, e pre-incubação no amortecedor glicose-esgotado são examinados e os valores óptimos são relatados. Este procedimento demonstra que a pré-incubação de eritrócitos em um amortecedor livre de glicose aumenta significativamente a porcentagem de eritrose em comparação com tampão contendo glicose. Este protocolo pode ser usado em laboratório para produzir eritrócitos eritptoticos para várias aplicações.

Protocol

Todas as amostras de sangue humanas utilizadas no protocolo descrito abaixo foram compradas como amostras desidentificadas. Nenhum sujeito humano foi diretamente envolvido ou recrutado para este estudo. As orientações da Declaração de Helsínquia devem ser utilizadas quando a investigação envolve seres humanos. 1. Isolamento eritrócito de sangue inteiro Adicione 500 μL de sangue inteiro em dextrose citrato ácido (ACD) (armazenado a 4 °C) a um tubo de microcentrífuga.NO…

Representative Results

Otimização da concentração de ionomicina Enquanto a ionomicina é necessária para induzir eritrose, o aumento das concentrações de ionomicina pode levar à hemolíse (ou seja, lise de eritrócitos e liberação de hemoglobina), que precisa ser evitada. O tratamento dos eritrócitos com 1 μM ionomicina na solução Ringer para 2 h é suficiente para induzir eritptose, como evidenciado pela rotulagem bem s…

Discussion

O objetivo deste procedimento é fornecer valores ideais para a concentração de ionóforo, tempo de tratamento e concentração de glicose extracelular, que são fatores importantes para garantir a indução bem-sucedida da eryptose. Um passo crítico no protocolo é o esgotamento da glicose extracelular, que, apesar de sua importância, não tem sido suficientemente enfatizada na literatura. O teor de açúcar na solução ringer normal (5 mM) tem um efeito inibitório sobre a eryptose. O esgotamento da glicose no amb…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pelo NIH grant R15ES030140 e NSF concessão CBET1903568. O apoio financeiro da Russ College of Engineering and Technology e do Departamento de Engenharia Química e Biomolecular da Universidade de Ohio também é reconhecido.

Materials

96-well plate Fisher Scientific 12-565-331
Annexin V Alexa Fluor 488 – apoptosis kit Fisher Scientific A10788 Store at 4 °C
BD FACSAria II flow cytometer BD Biosciences 643177
CaCl2 Fisher Scientific C79-500
Centrifuge Millipore Sigma M7157 Model Eppendorf 5415C
Confocal fluorescence microscopy Zeiss, LSM Tek Thornwood Model LSM 510, Argon laser excited at 488 nm for taking images
Cover glasses circles Fisher Scientific 12-545-100
Disposable round bottom flow cytometry tube VWR VWRU47729-566
DMSO Sigma-Aldrich 472301-100ML
DPBS VWR Life Science SH30028.02
Glucose monohydrate Sigma-Aldrich Y0001745
HEPES Buffer (1 M) Fisher Scientific 50-751-7290 Store at 4 °C
Ionomycin calcium salt EMD Milipore Corp. 407952-1MG Dissolve in DMSO to reach 2 mM. Store at -20 °C
KCl Fisher Scientific P330-500
MgSO4 Fisher Scientific M65-500
Microcentrifuge tube Fisher Scientific 02-681-5
NaCl Fisher Scientific S271-500
Plain glass microscope slides Fisher Scientific 12-544-4
Synergy HFM microplate reader BioTek
Whole blood in ACD Zen-Bio Store at 4 °C and warm to 37 °C prior to use

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Cite This Article
Bigdelou, P., Farnoud, A. M. Induction of Eryptosis in Red Blood Cells Using a Calcium Ionophore. J. Vis. Exp. (155), e60659, doi:10.3791/60659 (2020).

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