カルシウムイオノフォアを用いた赤血球中の赤血球誘導

赤血球のプログラム細胞死は、赤血球とも呼ばれ、多くの臨床状態および血腫性疾患で一般的である。赤血球症は、細胞形質膜^1、2における細胞収縮およびリン脂質非対称性の喪失に関連する。非対称性の喪失は、通常内側リーフレット^3、4に局在する脂質であるホスファチジルセリン(PS)を細胞外リーフレットに転位させ、マクロファージにシグナルを送り、欠陥のある赤血球^{5、6、7、8}を除去する。赤血球の正常寿命の終わりに、マクロファージによる赤血球の除去は、循環中の赤血球のバランスを保証する。しかしながら、鎌状赤血球症およびサラセミア^9、10、11などの疾患状態では、赤血球症の増強が重症貧血²をもたらし得る。血行性疾患における重要性から、赤血球症を誘発または阻害する因子と、この過程の基礎となる分子機構を調べることに大きな関心がある。

健康な赤血球の形質膜は非対称であり、異なるリン脂質が外側と内側のリーフレットに局在する。膜非対称性は、主に膜酵素の作用によって調節される。アミノリン脂質トランスロカーゼは、アミノリン脂質、PSおよびホスファチジルエタノールアミン(PE)の輸送を促進し、これらの脂質を細胞内リーフレットに導くことによって。一方、フロフパーゼは、リン脂質を含むコリンを輸送し、ホスファチジルコリン(PC)およびスフィンゴミエリン(SM)を、細胞膜¹²の内側から外側のリーフレットに輸送する。しかし、健康な細胞とは異なり、赤球の膜はスクランブルされます。これは、第3の酵素の作用によるもので、スクランバゼは、アミノリン脂質13、14、15、16の双方向輸送を促進することによりリン脂質非対称性を破壊する。スクランマゼは^、Ca2+の高い細胞内レベルによって活性化される。従って、細胞膜¹²を横切る^Ca2+の輸送を容易にするカルシウムイオノフォアは、赤血球症の効率的な誘導剤である。

イオノマイシンは、イオノフォアカルシウムであり、赤血球12、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26で赤血球中の赤血球を誘導するために広く使用されている。イオノマイシンは^、Ca2+イオンを結合および捕捉し、それを細胞質空間^27、28、29に輸送するために必要な親水性基および疎水性基の両方を有する。これは、スクランブラーゼの活性化およびPSの外側リーフレットへの転位につながり、これは^、PS12に対する親和性が高い細胞タンパク質であるアネキシンVを用いて容易に検出することができる。イオノマイシンによるエリプトーシスの誘発は一般的に報告されているが、文献にはかなりの方法の不一致がある(表1)。赤血球の集団は、イオノフォア濃度、イオノフォアによる治療時間、および細胞外環境の糖度(グルコース枯渇がカチオンチャネルを活性化し、細胞質空間への^Ca2+の侵入を容易にする^)30、31などの異なる要因に依存する。しかし、文献ではこれらの因子にはほとんど一貫性がなく、インビトロで再現的に赤血球症を行うことが困難である。

このプロトコルでは、ヒト赤血球において赤血球を誘導する段階的な手順を提示する。^Ca2+濃度、イオノフォア濃度、治療時間、グルコース枯渇緩衝液中のプレインキュベーションを含む成功したエリプトーシスに影響を与える因子を調べ、最適な値が報告される。この手順は、グルコースフリー緩衝液中の赤血球のプレインキュベーションが、グルコース含有緩衝液と比較して赤血球症の割合を有意に増加することを示す。このプロトコルは、様々な用途に対して赤血球を作製するために実験室で使用することができます。