Induzione dell'eriptosi nei globuli rossi utilizzando un ionoforo di calcio

La morte cellulare programmata negli eritrociti, nota anche come eriptosi, è comune in molte condizioni cliniche e disturbi ematologici. L’eryptosi è associata al restringimento cellulare e alla perdita di asimmetria fosfolipidide nella membrana plasmatica cellulare^1,2. La perdita di asimmetria provoca la traslocazione della fosfatidiladila (PS), un lipido normalmente localizzato nell’opuscolo interno^3,4, nel volantino esterno della cellula, che segnala ai macrofagi di fagocitosi e rimuove gli eritrociti difettosi^5,6,7,8. Alla fine della normale durata della vita degli eritrociti, la rimozione delle cellule eriftotiche dai macrofagi garantisce l’equilibrio degli eritrociti in circolazione. Tuttavia, in condizioni di malattia, come la malattia delle cellule falciformi e talassemia^9,10,11, una maggiore eryptosi può provocare anemia grave². A causa della sua importanza nelle malattie ematologiche, c’è un interesse significativo nell’esaminare i fattori che inducono o inibiscono l’eryptosi e i meccanismi molecolari alla base di questo processo.

La membrana plasmatica di eritrociti sani è asimmetrica, con diversi fosfolipidi che si localizzano nei volantini esterni e interni. L’asimmetria della membrana è regolata principalmente dall’azione degli enzimi della membrana. La translocasi aminofosofilidi consente il trasporto di aminoofosbantidi, PS e fosfatidylethanolamina (PE), indirizzando questi lipidi al foglietto interno della cellula. D’altra parte, il floppase trasporta la colina contenente fosfolipidi, fosfatidilcolina (PC) e sphingomyelin (SM), dal volantino interno a quello esterno della membrana cellulare¹². Tuttavia, a differenza delle cellule sane, la membrana degli eritrociti erittoticiti è strapazzata. Ciò è dovuto all’azione di un terzo enzima, la scramblase, che interrompe l’asimmetria fosfolipidi facilitando il trasporto bidirezionale degli aminoofolipidi^13,14,15,16. La Scramblase viene attivata da livelli intracellulari elevati di Ca^2. Pertanto, gli ionofori di calcio, che facilitano il trasporto di Ca^{2 o} attraverso la membrana cellulare¹², sono efficienti induttori di eriptosi.

Ionomycin, un ionoforo di calcio, è stato ampiamente utilizzato per indurre eryptosi in eritrocites^{12,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26}. L’ionomicina ha sia gruppi idrofili che idrofobici, che sono necessari per legare e catturare gli ioni Ca² e trasportarlo nello spazio citosolico^27,28,29. Questo porta all’attivazione della scramblase e alla traslocazione di PS al volantino esterno, che può essere facilmente rilevato utilizzando l’allegato-V, una proteina cellulare ad alta affinità con PS¹². Sebbene sia comunemente riportata l’eriptosi mediante ionomycina, vi è una notevole discrepanza di metodi nella letteratura (Tabella 1). La popolazione di eritrociti sottoposti a eriptosi dipende da diversi fattori come la concentrazione di ionoforo, il tempo di trattamento con l’ionoforo e il contenuto di zucchero dell’ambiente extracellulare (l’esaurimento del glucosio attiva i canali di cation e facilita l’ingresso di Ca^2, nello spazio citoco)^30,31. Tuttavia, c’è poca coerenza in questi fattori nella letteratura, rendendo difficile eseguire l’eryptosi riproducibilmente in vitro.

In questo protocollo, presentiamo una procedura passo-passo per indurre l’eriptosi negli eritrociti umani. Vengono esaminati i fattori che influiscono sul successo dell’eryptosi, tra cui la concentrazione di Ca^{2o, la} concentrazione di ionoforo, il tempo di trattamento e la pre-incubazione nel buffer impoverito di glucosio e vengono riportati valori ottimali. Questa procedura dimostra che la pre-incubazione degli eritrociti in un buffer privo di glucosio aumenta significativamente la percentuale di eryptosi rispetto al buffer contenente glucosio. Questo protocollo può essere utilizzato in laboratorio per produrre eritrociti eritotici per varie applicazioni.