אינדוקציה של אירוטוזה בתאי דם אדומים באמצעות היואופלפור סידן

מוות תאים מתוכנת ב אריתרופוציטים, הידוע גם בשם eryptosis, הוא נפוץ בתנאים קליניים רבים הפרעות המטולוגית. Eryptosis קשורה להתכווצות התאים ואובדן פוספוליפיד-סימטריה בקרום פלזמה התא^1,2. אובדן של א. א. א. תוצאות ב רוברטסוניים של זרחן (PS), שומנים בדרך כלל מקומי בעלון הפנימי^3,4, אל העלון החיצוני התא, אשר אותות מקרופאגים כדי phagocytose ולהסיר אריתרופוציטים פגום^5,6,7,8. בסוף תוחלת החיים הנורמלית של אריתרופוציטים, הסרת התאים eryptotic על ידי מקרופאגים מבטיח את האיזון של אריתרופוציטים במחזור הדם. עם זאת, בתנאים חולים, כגון מחלת תאים מגל ו תלסמיה^9,10,11, eryptosis משופרת עלולה לגרום לאנמיה חמורה². בשל חשיבותו במחלות המטולוגית, יש עניין משמעותי בבדיקת הגורמים העלולים להיות מעכבים או לעכב את המנגנונים המולקולריים ואת המנגנון המולקולרי שבבסיס תהליך זה.

קרום הפלזמה של אריתרופוציטים בריאים הוא אסימטרי, עם שונים פוספוליפידים לוקליזציה על העלונים החיצוניים והפנימיים. א-סימטריה ממברנה מוסדר בעיקר על ידי פעולה של אנזימים ממברנה. Aminophospholipid טרנסלוקייס מקלה על ההובלה של aminophospholipids, PS ו פוספולידילטהולאמין (PE), על ידי הנחיית שומנים אלה אל העלון הפנימי של התא. מצד שני, floppase מסיע את כולין המכיל פוספוליפידים, זרחן (PC) ו ספינגומיילין (SM), מן הפנימי אל העלעל החיצוני של קרום התא¹². עם זאת, בניגוד לתאים בריאים, קרום של האריתרופוציטים eryptotic מעורבל. הדבר נובע מהפעולה של אנזים שלישי, השבלקלז, אשר משבש פוספוליפיד על אי-סימטריה על ידי הקלה על ההובלה הדו-כיוונית של aminophospholipids^13,14,15,16. הסמבלאז מופעל על ידי רמות תאיים גבוהות של Ca^{2 +}. לכן, סידן ionophores, אשר להקל על ההובלה של Ca^{2 +} על פני קרום התא¹², הם השראות יעיל של אריפיסיס.

איקונמיצין, סידן מיואופלפור, נעשה שימוש נרחב כדי לגרום לאריטוסיס ב אריתרופוציטים^{12,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26}. איקונמיצין יש גם קבוצות ידרופילי ו הידרופובי, אשר נחוצים כדי לאגד וללכוד Ca^{2 +} יון, ולהעביר אותו לחלל ציטוסולג^27,28,29. הדבר מוביל להפעלת הסמבלאז והטרנסלוקציה של PS לעלעל החיצוני, שניתן לאתרם בקלות באמצעות השימוש ב-אנסי-V, חלבון תאי בעל זיקה גבוהה ל-PS¹². למרות שמפעיל את האירוטוזה על ידי איקונמיצין מדווחים בדרך כלל, יש אי-התאמה ניכרת בשיטה בספרות (שולחן 1). האוכלוסייה של אריתרופוציטים שעברו אריטוציטוזה תלוי בגורמים שונים כגון ריכוז ביוופפור, זמן טיפול עם היופופור, ואת תכולת הסוכר של הסביבה המרחפת (גלוקוז המחסור מפעיל ערוצי הקטיון ומקל את הכניסה של Ca^{2 +} לתוך שטח cytosolic)^30,31. עם זאת, יש מעט עקביות בגורמים אלה בספרות, מה שמקשה על ביצוע של האריטוסיס בלתי מתורבת.

בפרוטוקול זה, אנו מציגים הליך צעד אחר צעד כדי לזרז את התהליך של אריתרופוציטים אנושיים. הגורמים המשפיעים על האריטוסיס המצליח כולל Ca^{2 +} ריכוז, ריכוז ביופור, זמן טיפול, וטרום דגירה במאגר מרוקן גלוקוז נבדקים ערכים אופטימליים מדווחים. הליך זה מדגים כי טרום דגירה של אריתרופוציטים במאגר נטול גלוקוז מגדיל באופן משמעותי את אחוז האריטוזה לעומת מאגר המכיל גלוקוז. פרוטוקול זה יכול לשמש במעבדה כדי לייצר האריציטים eryptotic עבור יישומים שונים.