Induktion der Eryptose in roten Blutkörperchen mit einem Calcium-Ionophor
Summary
Ein Protokoll zur Induktion von Eryptose, programmierter Zelltod in Erythrozyten, mit dem Calciumionophor, Ionomycin, wird zur Verfügung gestellt. Erfolgreiche Eryptose wird durch Dieüberwachung der Lokalisation Phosphatidylserin in der Membran äußere Packungsbeilage bewertet. Faktoren, die den Erfolg des Protokolls beeinflussen, wurden untersucht und optimale Bedingungen bereitgestellt.
Abstract
Eryptose, Erythrozyten programmiertzelltod, tritt bei einer Reihe von hämatologischen Erkrankungen und während der Verletzung von Erythrozyten. Ein Kennzeichen eryptotischer Zellen ist der Verlust der kompositorischen Asymmetrie der Zellmembran, die zur Translokation von Phosphatidylserin in die äußere Membranbroschüre führt. Dieser Prozess wird durch eine erhöhte intrazelluläre Konzentration von Ca2+ausgelöst, die Scramblase aktiviert, ein Enzym, das die bidirektionale Bewegung von Phospholipiden zwischen Membranbroschüren erleichtert. Angesichts der Bedeutung der Eryptose unter verschiedenen krankheiten gab es Bemühungen, Eryptose in vitrozu induzieren. Solche Bemühungen haben sich im Allgemeinen auf das Calciumionophor, Ionomycin, zur Verbesserung der intrazellulären Ca2+-Konzentration und induzieren Eryptose verlassen. Jedoch, viele Diskrepanzen wurden in der Literatur über das Verfahren zur Induktion von Eryptose mit Ionomycin berichtet. Hierin berichten wir über ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für Ionomycin-induzierte Eryptose bei menschlichen Erythrozyten. Wir konzentrieren uns auf wichtige Schritte im Verfahren, einschließlich der Ionophorkonzentration, Inkubationszeit und Glukoseermangel, und liefern repräsentative Ergebnisse. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um Reproduzierbar Eryptose im Labor zu induzieren.
Introduction
Programmierter Zelltod bei Erythrozyten, auch bekannt als Eryptose, ist bei vielen klinischen Erkrankungen und hämatologischen Erkrankungen häufig. Eryptose ist mit Zellschrumpfung und dem Verlust der Phospholipid-Asymmetrie in der Zellplasmamembran1,2verbunden. Der Verlust der Asymmetrie führt zur Translokation von Phosphatidylserin (PS), einem Lipid, das normalerweise in der inneren Packungsbeilage3,4, zur äußeren Zellbroschüre lokalisiert ist, die Anmacrophagen an Phagozytose sendet und defekte Erythrozyten5,6,7,8. Am Ende der normalen Lebensdauer von Erythrozyten sorgt die Entfernung eryptotischer Zellen durch Makrophagen für das Gleichgewicht der erythrozyten im Umlauf. Jedoch, bei kranken Bedingungen, wie Sichelzellerkrankung und Thalassämie9,10,11, verbesserte Eryptose kann zu schwerer Anämie führen2. Aufgrund seiner Bedeutung bei hämatologischen Erkrankungen besteht ein erhebliches Interesse an der Untersuchung der Faktoren, die die Eryptose auslösen oder hemmen, und der molekularen Mechanismen, die diesem Prozess zugrunde liegen.
Die Plasmamembran gesunder Erythrozyten ist asymmetrisch, wobei verschiedene Phospholipide an den äußeren und inneren Blättchen lokalisiert werden. Membranasymmetrie wird in erster Linie durch die Wirkung von Membranenzymen reguliert. Aminophospholipid translocase erleichtert den Transport von Aminophospholipiden, PS und Phosphatidylethanolamin (PE), indem diese Lipide auf die innere Packungsbeilage der Zelle geleitet werden. Auf der anderen Seite transportiert Floppase das Cholin enthaltende Phospholipide, Phosphatidylcholin (PC) und Sphingomyelin (SM), von der inneren zur äußeren Packungsbeilage der Zellmembran12. Im Gegensatz zu gesunden Zellen wird die Membran eryptotischer Erythrozyten jedoch durchwühlt. Dies ist auf die Wirkung eines dritten Enzyms, Scramblase, zurückzuführen, das die Phospholipid-Asymmetrie durch die Erleichterung des bidirektionalen Transports von Aminophospholipiden13,14,15,16stört. Scramblase wird durch erhöhte intrazelluläre Konzentrationen von Ca2+aktiviert. Daher sind Calciumionophore, die den Transport von Ca2+ über die Zellmembran12erleichtern, effiziente Induktoren der Eryptose.
Ionomycin, ein Calcium-Ionophor, wurde weit verbreitet, um Eryptose in Erythrozyten12,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26zu induzieren. Ionomycin hat sowohl hydrophile als auch hydrophobe Gruppen, die notwendig sind, um Ca2+ Ion zu binden und zu erfassen und in den zytosolischen Raum27,28,29zu transportieren. Dies führt zur Aktivierung von Scramblase und Translokation von PS in die äußere Packungsbeilage, die leicht mit Annexin-V, einem zellulären Protein mit einer hohen Affinität zu PS12,nachgewiesen werden kann. Obwohl die Auslösung der Eryptose durch Ionomycin häufig berichtet wird, besteht eine erhebliche Methodabweichung in der Literatur (Tabelle 1). Die Population der Erythrozyten, die sich einer Eryptose unterziehen, hängt von verschiedenen Faktoren wie der Ionophorkonzentration, der Behandlungszeit mit Ionophor und dem Zuckergehalt der extrazellulären Umgebung ab (Glukose-Erschöpfung aktiviert Kationenkanäle und erleichtert den Eintritt von Ca2+ in den zytosolischen Raum)30,31. Allerdings gibt es wenig Konsistenz in diesen Faktoren in der Literatur, so dass es schwierig ist, Eryptose reproduzierbar in vitrodurchzuführen.
In diesem Protokoll stellen wir ein Schrittweiseverfahren zur Induziniösisierung von Eryptose bei menschlichen Erythrozyten vor. Es werden Faktoren untersucht, die eine erfolgreiche Eryptose beeinflussen, einschließlich Ca2+-Konzentration, Ionophorkonzentration, Behandlungszeit und Vorinkubation im Glukose-Erschöpften Puffer und es werden optimale Werte gemeldet. Dieses Verfahren zeigt, dass die Vorinkubation von Erythrozyten in einem glukosefreien Puffer den Prozentsatz der Eryptose im Vergleich zum glukosehaltigen Puffer signifikant erhöht. Dieses Protokoll kann im Labor verwendet werden, um eryptotische Erythrozyten für verschiedene Anwendungen zu produzieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ziel dieses Verfahrens ist es, optimale Werte für die Ionophorkonzentration, die Behandlungszeit und die extrazelluläre Glukosekonzentration zu liefern, die wichtige Faktoren für eine erfolgreiche Induktion der Eryptose sind. Ein kritischer Schritt im Protokoll ist die Erschöpfung der extrazellulären Glukose, die trotz ihrer Bedeutung in der Literatur nicht ausreichend betont wurde. Der Zuckergehalt in normaler Ringer-Lösung (5 mM) wirkt hemmend auf die Eryptose. Glukosemangel in der extrazellulären Umgebung induz…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch den NIH-Zuschuss R15ES030140 und den NSF-Zuschuss CBET1903568 unterstützt. Die finanzielle Unterstützung durch das Russ College of Engineering and Technology und das Department of Chemical and Biomolecular Engineering an der Ohio University wird ebenfalls anerkannt.
Materials
| 96-well plate | Fisher Scientific | 12-565-331 | |
| Annexin V Alexa Fluor 488 – apoptosis kit | Fisher Scientific | A10788 | Store at 4 °C |
| BD FACSAria II flow cytometer | BD Biosciences | 643177 | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Centrifuge | Millipore Sigma | M7157 | Model Eppendorf 5415C |
| Confocal fluorescence microscopy | Zeiss, LSM Tek Thornwood | Model LSM 510, Argon laser excited at 488 nm for taking images | |
| Cover glasses circles | Fisher Scientific | 12-545-100 | |
| Disposable round bottom flow cytometry tube | VWR | VWRU47729-566 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 472301-100ML | |
| DPBS | VWR Life Science | SH30028.02 | |
| Glucose monohydrate | Sigma-Aldrich | Y0001745 | |
| HEPES Buffer (1 M) | Fisher Scientific | 50-751-7290 | Store at 4 °C |
| Ionomycin calcium salt | EMD Milipore Corp. | 407952-1MG | Dissolve in DMSO to reach 2 mM. Store at -20 °C |
| KCl | Fisher Scientific | P330-500 | |
| MgSO4 | Fisher Scientific | M65-500 | |
| Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 02-681-5 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Plain glass microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
| Synergy HFM microplate reader | BioTek | ||
| Whole blood in ACD | Zen-Bio | Store at 4 °C and warm to 37 °C prior to use |
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