Induction de l'éryptose dans les globules rouges à l'aide d'un ionophore de calcium
Summary
Un protocole pour l’induction de l’éryptose, la mort cellulaire programmée dans les érythrocytes, utilisant l’ionophore de calcium, l’ionomycine, est fourni. L’éryptose réussie est évaluée en surveillant la phosphatidylserine de localisation dans le foliole externe de membrane. Les facteurs qui influent sur le succès du protocole ont été examinés et des conditions optimales ont été fournies.
Abstract
L’éryptose, érythrocyte programmé la mort cellulaire, se produit dans un certain nombre de maladies hématologiques et pendant les dommages aux érythrocytes. Une caractéristique des cellules éryptotiques est la perte de l’asymétrie compositionnelle de la membrane cellulaire, conduisant à la translocation de la phosphatidylserine à la foliole externe de membrane. Ce processus est déclenché par une concentration intracellulaire accrue de Ca2,qui active la scramblase, une enzyme qui facilite le mouvement bidirectionnel des phospholipides entre les folioles membranaires. Compte tenu de l’importance de l’éryptose dans diverses conditions malades, il ya eu des efforts pour induire l’éryptose in vitro. Ces efforts ont généralement compté sur l’ionophore de calcium, l’ionomycine, pour augmenter la concentration intracellulaire de Ca2 et induire l’éryptosis. Cependant, beaucoup d’écarts ont été rapportés dans la littérature concernant la procédure pour induire l’éryptosis utilisant l’ionomycine. Ici, nous rapportons un protocole étape par étape pour l’éryptosis induit par l’ionomycine dans les érythrocytes humains. Nous nous concentrons sur les étapes importantes dans la procédure, y compris la concentration d’ionophore, le temps d’incubation, et l’épuisement de glucose, et fournissons le résultat représentatif. Ce protocole peut être utilisé pour induire une éryptose reproductible en laboratoire.
Introduction
La mort cellulaire programmée dans les érythrocytes, également connu sous le nom d’éryptosis, est commune dans beaucoup d’conditions cliniques et de désordres hématologiques. L’éryptose est associée au rétrécissement cellulaire et à la perte d’asymétrie phospholipide dans la membrane plasmatique cellulaire1,2. La perte d’asymétrie entraîne la translocation de la phosphatidylserine (PS), un lipide normalement localisé dans le dépliant intérieur3,4, à la foliole externe de la cellule, qui signale aux macrophages de phagocytose et d’enlever les érythrocytes défectueux5,6,7,8. À la fin de la durée de vie normale des érythrocytes, l’ablation des cellules éryptotiques par macrophages assure l’équilibre des érythrocytes en circulation. Cependant, dans les conditions malades, telles que la drépanocytose et la thalassémie9,10,11, éryptose améliorée peut entraîner une anémie sévère2. En raison de son importance dans les maladies hématologiques, il y a un intérêt significatif dans l’examen des facteurs induisant ou inhibant l’éryptosis et les mécanismes moléculaires sous-jacents à ce processus.
La membrane plasmatique des érythrocytes sains est asymétrique, avec différents phospholipides localisés aux folioles extérieures et intérieures. L’asymétrie membranaire est principalement régulée par l’action des enzymes membranaires. La translocase aminophospholipide facilite le transport des aminophospholipides, ps et phosphatidylethanolamine (PE), en dirigeant ces lipides vers le foliole interne de la cellule. D’autre part, le floppase transporte la choline contenant des phospholipides, de la phosphatidylcholine (PC) et de la sphingomyéline (SM), de l’intérieur à la foliole externe de la membrane cellulaire12. Cependant, contrairement aux cellules saines, la membrane des érythrocytes éryptotiques est brouillée. Cela est dû à l’action d’une troisième enzyme, scramblase, qui perturbe l’asymétrie phospholipide en facilitant le transport bidirectionnel des aminophospholipides13,14,15,16. Scramblase est activé par des niveaux intracellulaires élevés de Ca2. Par conséquent, les ionophores de calcium, qui facilitent le transport de Ca2 à travers la membrane cellulaire12,sont des inducteurs efficaces de l’éryptose.
Ionomycin, un ionophore de calcium, a été largement utilisé pour induire l’éryptose dans les érythrocytes12,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. Ionomycin a à la fois des groupes hydrophiles et hydrophobes, qui sont nécessaires pour lier et capturer Ca2 ion, et le transporter à l’espace cytosolique27,28,29. Cela conduit à l’activation de la broussase et la translocation de PS à la foliole externe, qui peut être facilement détectée à l’aide de l’annexine-V, une protéine cellulaire avec une forte affinité à PS12. Bien que l’éryptose de déclenchement par ionomycine soit généralement rapportée, il y a l’écart considérable de méthode dans la littérature (tableau 1). La population d’érythrocytes subissant l’éryptosis dépend de différents facteurs tels que la concentration d’ionophore, le temps de traitement avec l’ionophore, et la teneur en sucre de l’environnement extracellulaire (l’épuisement de glucose active des canaux de cation et facilite l’entrée de Ca2 dans l’espace cytosolique)30,31. Cependant, il y a peu de cohérence dans ces facteurs dans la littérature, ce qui rend difficile d’effectuer l’éryptose reproductiblement in vitro.
Dans ce protocole, nous présentons une procédure étape par étape pour induire l’éryptosis dans les érythrocytes humains. Les facteurs affectant l’éryptose réussie, y compris la concentration de Ca2, la concentration d’ionophore, le temps de traitement, et la pré-incubation dans le tampon glucose-appauvri sont examinés et des valeurs optimales sont rapportées. Cette procédure démontre que la pré-incubation des érythrocytes dans un tampon sans glucose augmente considérablement le pourcentage d’éryptosis par rapport au tampon contenant du glucose. Ce protocole peut être utilisé en laboratoire pour produire des érythrocytes éryptotiques pour diverses applications.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le but de cette procédure est de fournir des valeurs optimales pour la concentration d’ionophore, le temps de traitement, et la concentration extracellulaire de glucose, qui sont des facteurs importants en assurant l’induction réussie de l’éryptosis. Une étape critique dans le protocole est l’épuisement du glucose extracellulaire, qui, en dépit de son importance, n’a pas été suffisamment souligné dans la littérature. La teneur en sucre dans la solution Ringer normale (5 mM) a un effet inhibiteur sur l’éryptose…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la subvention des NIH R15ES030140 et la subvention DE nSF CBET1903568. Le soutien financier du Russ College of Engineering and Technology et du Département de génie chimique et biomoléculaire de l’Université de l’Ohio est également reconnu.
Materials
| 96-well plate | Fisher Scientific | 12-565-331 | |
| Annexin V Alexa Fluor 488 – apoptosis kit | Fisher Scientific | A10788 | Store at 4 °C |
| BD FACSAria II flow cytometer | BD Biosciences | 643177 | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Centrifuge | Millipore Sigma | M7157 | Model Eppendorf 5415C |
| Confocal fluorescence microscopy | Zeiss, LSM Tek Thornwood | Model LSM 510, Argon laser excited at 488 nm for taking images | |
| Cover glasses circles | Fisher Scientific | 12-545-100 | |
| Disposable round bottom flow cytometry tube | VWR | VWRU47729-566 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 472301-100ML | |
| DPBS | VWR Life Science | SH30028.02 | |
| Glucose monohydrate | Sigma-Aldrich | Y0001745 | |
| HEPES Buffer (1 M) | Fisher Scientific | 50-751-7290 | Store at 4 °C |
| Ionomycin calcium salt | EMD Milipore Corp. | 407952-1MG | Dissolve in DMSO to reach 2 mM. Store at -20 °C |
| KCl | Fisher Scientific | P330-500 | |
| MgSO4 | Fisher Scientific | M65-500 | |
| Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 02-681-5 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Plain glass microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
| Synergy HFM microplate reader | BioTek | ||
| Whole blood in ACD | Zen-Bio | Store at 4 °C and warm to 37 °C prior to use |
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