Inductie van Eryptosis in rode bloedcellen met behulp van een calcium-Ionophore

Geprogrammeerde celdood in erytrocyten, ook bekend als eryptosis, is gebruikelijk in vele klinische aandoeningen en hematologische aandoeningen. Eryptosis wordt geassocieerd met celkrimp en het verlies van fosfolipide asymmetrie in de cel plasma membraan^1,2. Verlies van asymmetrie resultaten in de translocatie van fosfatidylserine (PS), een lipide normaal gelokaliseerd in de binnenste bijsluiter^3,4, naar de buitenste bijsluiter van de cel, die signalen naar macrofagen aan fagocytose en verwijderen defecte erytrocyten^5,6,7,8. Aan het einde van de normale levensduur van erytrocyten zorgt het verwijderen van eryptotische cellen door macrofagen voor het evenwicht van erytrocyten in omloop. Echter, in zieke omstandigheden, zoals sikkelcelziekte en thalassemie^9,10,11, verbeterde eryptosis kan resulteren in ernstige anemie². Vanwege het belang in hematologische ziekten, is er belangrijke belangstelling voor het onderzoeken van de factoren inducerende of remmende eryptosis en de moleculaire mechanismen die aan dit proces ten grondslag liggen.

Het plasma membraan van gezonde erytrocyten is asymmetrisch, met verschillende fosfolipiden lokaliseren op de buitenste en binnenste folders. Membraan asymmetrie wordt voornamelijk gereguleerd door de werking van membraan enzymen. Aminopfosfolipide translocase vergemakkelijkt het transport van aminophospholipiden, PS en fosfatidylethanolamine (PE), door deze lipiden naar de binnenste folder van de cel te sturen. Aan de andere kant, floppase vervoert de choline met fosfolipiden, dunlaag (PC) en sphingomyelinase (SM), van de binnenste naar de buitenste bijsluiter van de cel membraan¹². Echter, in tegenstelling tot gezonde cellen, het membraan van eryptotic erytrocyten is vervormd. Dit komt door de werking van een derde enzym, scramblase, dat de fosfolipide asymmetrie verstoort door het bidirectionele transport van aminophospholipiden^13,14,15,16te vergemakkelijken. Scramblase wordt geactiveerd door verhoogde intracellulaire niveaus van CA^{2 +}. Daarom zijn calcium-ionoforen, die het transport van CA^{2 +} over het celmembraan¹²faciliteren, efficiënte inductoren van eryptosis.

Ionomycine, een calcium-ionophore, is op grote schaal gebruikt voor het opwekken van eryptosis in erytrocyten^{12,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26}. Ionomycine heeft zowel hydrofiele als hydrofobe groepen, die nodig zijn om ca^{2 +} Ion te binden en te vangen, en deze te transporteren naar de cytosolische ruimte^27,28,29. Dit leidt tot de activering van de scramblase en translocatie van PS naar de buitenste bijsluiter, die gemakkelijk kan worden gedetecteerd met behulp van annexin-V, een cellulair eiwit met een hoge affiniteit voor PS¹². Hoewel het triggeren van eryptosis door ionomycine vaak wordt gerapporteerd, is er een aanzienlijke methode discrepantie in de literatuur (tabel 1). De populatie van erytrocyten die eryptosis ondergaan, hangt af van verschillende factoren zoals ionofiele concentratie, behandelingstijd met ionofoor, en het suikergehalte van extracellulaire omgeving (glucose depletie activeert catie kanalen en vergemakkelijkt de intrede van CA^{2 +} in de cytosolische ruimte)^30,31. Er is echter weinig consistentie in deze factoren in de literatuur, waardoor het moeilijk is om eryptosis reproductief in vitrouit te voeren.

In dit protocol presenteren we een stapsgewijze procedure voor het opwekken van eryptosis in menselijke erytrocyten. Factoren die van invloed zijn op succesvolle eryptosis, waaronder CA^{2 +} concentratie, ionofiele concentratie, behandelingstijd, en pre-incubatie in glucose-verarmd buffer worden onderzocht en optimale waarden worden gerapporteerd. Deze procedure toont aan dat de pre-incubatie van erytrocyten in een glucose vrije buffer het percentage van de eryptosis aanzienlijk verhoogt in vergelijking met de glucose-bevattende buffer. Dit protocol kan in het laboratorium worden gebruikt om eryptotische erytrocyten te produceren voor verschillende toepassingen.