Fare Embriyonik Hücrelerinin Çok katlı Tek Hücreli mRNA Sıralama Analizi
Summary
Burada fare embriyonik dokularında gen ekspresyonunu profillemek için çok katlı tek hücreli mRNA dizileme yöntemi ni sunduk. Damlacık tabanlı tek hücreli mRNA dizileme (scRNA-Seq) yöntem çoklama stratejileri ile birlikte aynı anda birden fazla örnekten tek hücre profili olabilir, hangi önemli ölçüde reaktif maliyetlerini azaltır ve deneysel toplu etkileri en aza indirir.
Abstract
Tek hücreli mRNA dizilimi son birkaç yılda önemli ilerlemeler kaydetmiştir ve gelişim biyolojisi alanında önemli bir araç haline gelmiştir. Nadir hücre popülasyonlarını belirlemek, yeni işaretgenleri keşfetmek ve mekansal ve zamansal gelişimsel bilgileri çözmek için başarıyla kullanılmıştır. Tek hücreli yöntem de son iki ila üç yıl içinde damlacık tabanlı çözümler mikroakışkan bazlı Fluidigm C1 teknolojisi gelişti. Burada damlacık tabanlı scRNA-Seq yöntemini kullanarak fare embriyonik doku hücrelerinin profilini göstermek için bir örnek olarak kalp kullanılır. Buna ek olarak, tek bir deneyde birden fazla örneği profillemek için iş akışına iki strateji entegre ettik. Entegre yöntemlerden birini kullanarak, aynı anda sekiz kalp örneğinden 9.000’den fazla hücrenin profilini çıkarmış olduk. Bu yöntemler, farklı genetik geçmişlerden, gelişim evrelerinden veya anatomik konumlardan tek hücreleri aynı anda profillemek için uygun maliyetli bir yol sağlayarak gelişimbiyolojisi alanında değerli olacaktır.
Introduction
Her bir hücrenin transkripsiyon profili embriyonik gelişim sırasında hücre popülasyonları arasında değişir. Tek moleküler in situ hibridizasyon genlerin az sayıda ekspresyonu görselleştirmek için kullanılabilir rağmen1, tek hücreli mRNA sıralama (scRNA-Seq) tek hücrelerde genlerin genom çapında ifade desenleri göstermek için tarafsız bir yaklaşım sağlar. İlk olarak 2009 yılında yayınlandıktan sonra2, scRNA-Seq son yıllarda birden fazla gelişim aşamasında birden fazla doku çalışması için uygulanmıştır3,4,5. Ayrıca, insan hücre atlası son zamanlarda gelişimodaklı projelerini başlattığı için, yakın gelecekte insan embriyonik dokularından daha fazla tek hücre verisi oluşturulması beklenmektedir.
Geliştirmek için ilk organ olarak kalp embriyonik gelişiminde kritik bir rol oynar. Kalp birden fazla hücre tiplerinden oluşur ve her hücre tipinin gelişimi zamansal ve mekansal olarak sıkı bir şekilde düzenlenir. Son birkaç yıl içinde, erken gelişim aşamalarında kardiyak hücrelerin kökeni ve hücre soyu karakterize edilmiştir6, konjenital kalp hastalığı patogenezini anlamak için muazzam bir yararlı navigasyon aracı sağlamak, hem de kardiyomiyosit rejenerasyon teşvik etmek için daha teknolojik olarak gelişmiş yöntemler geliştirmek için7.
ScRNA-Seq son yıllarda hızlı bir genişleme uğramıştır8,9,10. Yeni geliştirilen yöntemlerle, tek hücreli deneylerin tasarımı ve analizi daha ulaşılabilir hale gelmiştir11,12,13,14. Burada sunulan yöntem damlacık çözümlerine dayalı ticari bir prosedürdür (bkz. Malzeme Tablosu)15,16. Bu yöntem, mikroakışkan kontrol sisteminin kontrolü altında bir yağ-su emülsiyon damlacık hücreleri ve benzersiz barkodlu boncuk setleri yakalama özellikleri. Damlacıklara hücre yükleme hızı son derece düşüktür, böylece damlacık emülsiyonlarının çoğu sadece bir hücre içerir17. Prosedürün dahice tasarımı, tek hücreli tek hücreli emülsiyonların barkodlama ile eş zamanlı olarak meydana gelmesinden gelir ve bu da heterojen bir popülasyonda RNA-Seq kullanan hücrelerin paralel analizini sağlar.
Çoklama stratejilerinin birleştirilmesi, geleneksel tek hücreli iş akışı13,14’eyapılan önemli eklemelerden biridir. Bu ek hücre doublets atarak çok yararlıdır, deneysel maliyetleri azaltmak, ve toplu etkileri ortadan kaldırarak18,19. Lipid bazlı barkodlama stratejisi ve antikor bazlı barkodlama stratejisi (bkz. Malzemeler Tablosu)çoğunlukla kullanılan iki çokluk yöntemidir. Her iki yöntemde de her örneği etiketlemek için belirli barkodlar kullanılır ve etiketli örnekler daha sonra tek hücre yakalama, kitaplık hazırlama ve sıralama için karıştırılır. Daha sonra, havuzlu sıralama verileri barkod dizileri analiz edilerek ayrılabilir (Şekil 1)19. Ancak, iki yöntem arasında önemli farklılıklar vardır. Lipid bazlı barkodlama stratejisi herhangi bir hücre tipi tercihleri olduğu tespit edilmemiştir lipid-modifiye oligonükleotidler dayanmaktadır. Antikor tabanlı barkodlama stratejisi sadece antijen proteinleri ifade hücreleri tespit ederken19,20. Buna ek olarak, lipidler leke için yaklaşık 10 dakika sürer ama 40 dk antikorlar leke(Şekil 1). Ayrıca, lipid modifiye oligonükleotidler antikor-konjuge oligonükleotidler daha ucuz ama ticari olarak bu makalenin yazıldığı anda mevcut değildir. Son olarak, lipid tabanlı strateji bir deneyde 96 örneği çok katlayabilir, ancak antikor tabanlı strateji şu anda sadece 12 örneği çok katlayabilir.
Tek bir deneyde multipleks için önerilen hücre numarası 2,5 x 104daha düşük olmalıdır , aksi takdirde, hücre doublets ve potansiyel ortam mRNA kontaminasyon yüksek bir yüzdesi yol açacaktır. Çoklama stratejileri sayesinde, tek hücre yakalama, cDNA oluşturma ve birden fazla örnek için kitaplık hazırlama maliyeti bir örnek maliyetine düşürülür, ancak sıralama maliyeti aynı kalır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışmada, tek hücreli transkripsiyonel profilleri analiz etmek için bir protokol gösterdik. Ayrıca scRNA-Seq iş akışında multipleks örneklerine iki isteğe bağlı yöntem sunduk. Her iki yöntem çeşitli laboratuvarlarda uygulanabilir olduğunu kanıtlamıştır ve maliyet-etkin ve toplu etkisiz tek hücreli deney18çalıştırmak için çözümler sağladı,26.
Protokolden geçerken dikkatle uyulması gereken birkaç…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Zev J. Gartner laboratuvarından David M. Patterson ve Christopher S. McGinnis’e lipid bazlı barkodlama reaktifleri ve deneysel adımlar ve veri analizi önerileri için teşekkür ederiz. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (HL13347202) tarafından kurulmuştur.
Materials
| 10% Tween-20 | Bio-Rad | 1610781 | |
| 10x Chip Holder | 10x Genomics | 120252 330019 | |
| 10x Chromium Controller | 10x Genomics | 120223 | |
| 10x Magnetic Separator | 10x Genomics | 120250 230003 | |
| 10x Vortex Adapter | 10x Genomics | 330002, 120251 | |
| 10x Vortex Clip | 10x Genomics | 120253 230002 | |
| 4200 TapeStation System | Agilent | G2991AA | |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | University of Pittsburgh Health Sciences Sequencing Core |
| Barcode Oligo | Integrated DNA Technologies | Single-stranded DNA | 25 nmol |
| Buffer EB | Qiagen | 19086 | |
| CD1 mice | Chales River | Strain Code 022 | ordered pregnant mice |
| Centrifuge 5424R | Appendorf | 2231000214 | |
| Chromium Chip B Single Cell Kit, 48 rxns | 10x Genomics | 1000073 | Store at ambient temperature |
| Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns | 10x Genomics | 120262 | Store at -20 °C |
| Chromium Single Cell 3' GEM Kit v3,4 rxns | 10x Genomics | 1000094 | Store at -20 °C |
| Chromium Single Cell 3' Library Kit v3 | 10x Genomics | 1000095 | Store at -20 °C |
| Chromium Single Cell 3' v3 Gel Beads | 10x Genomics | 2000059 | Store at -80 °C |
| Collagenase A | Sigma/Millipore | 10103578001 | Store powder at 4 °C, store at -20 °C after it dissolves |
| Collagenase B | Sigma/Millipore | 11088807001 | Store powder at 4 °C, store at -20 °C after it dissolves |
| D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5582 | University of Pittsburgh Health Sciences Sequencing Core |
| DNA LoBind Tube Microcentrifuge Tube, 1.5 mL | Eppendorf | 022431021 | |
| DNA LoBind Tube Microcentrifuge Tube, 2.0 mL | Eppendorf | 022431048 | |
| Dynabeads MyOne SILANE | 10x Genomics | 2000048 | Store at 4 °C, used in Beads Cleanup Mix (Table 1) |
| DynaMag-2 Magnet | Theromo Scientific | 12321D | |
| Ethanol, Pure (200 Proof, anhydrous) | Sigma | E7023-500mL | |
| Falcon 15mL High Clarity PP Centrifuge Tube | Corning Cellgro | 14-959-70C | |
| Falcon 50mL High Clarity PP Centrifuge Tube | Corning Cellgro | 14-959-49A | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, United States | Fisher Scientific | 26140079 | Store at -20 °C |
| Finnpipette F1 Multichannel Pipettes, 10-100μl | Theromo Scientific | 4661020N | |
| Finnpipette F1 Multichannel Pipettes, 1-10μl | Theromo Scientific | 4661000N | |
| Flowmi Cell Strainer | Sigma | BAH136800040 | Porosity 40 μm, for 1000 uL Pipette Tips, pack of 50 each |
| Glycerin (Glycerol), 50% (v/v) | Ricca Chemical Company | 3290-32 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14170112 | |
| Human TruStain FcX (Fc Receptor Blocking Solution) | BioLegend | 422301 | Add 5 µl of Human TruStain FcX per million cells in 100 µl staining volume |
| Isopropanol (IPA) | Fisher Scientific | A464-4 | |
| Kapa HiFi HotStart ReadyMix (2X) | Fisher Scientific | NC0295239 | Store at -20 °C, used in Lipid-tagged barcode library mix (Table 1) |
| Lipid Barcode Primer (Multi-seq Primer) | Integrated DNA Technologies | Single-stranded DNA | 100 nmol |
| Low TE Buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1 mM EDTA) | Thermo Fisher Scientific | 12090-015 | |
| MasterCycler Pro | Eppendorf | 950W | |
| Nuclease-Free Water (Ambion) | Thermo Fisher Scientific | AM9937 | |
| PCR Tubes 0.2 ml 8-tube strips | Eppendorf | 951010022 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) 1X without calcium & magnesium | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) with 10% Bovine Albumin (alternative to Thermo Fisher product) | Sigma-Aldrich | SRE0036 | |
| Pipet 4-pack (0.1–2.5μL, 0.5-10μL, 10–100μL, 100–1,000μL variable-volume pipettes | Fisher Scientific | 05-403-151 | |
| Selection reagent (SPRIselect Reagent Kit) | Beckman Coulter | B23318 (60ml) | |
| Template Switch Oligo | 10x Genomics | 3000228 | Store at -20 °C, used in Master Mix (Table 1) |
| The antibody based barcoding strategy is also known as Cell Hashing | |||
| The cell browser is Loup Cell Browser | 10x Genomics | https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/visualization/latest/what-is-loupe-cell-browser | |
| The commercial available analysis pipline in step 8.1 is Cell Ranger | 10x Genomics | https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger | |
| The lipid based barcoding strategy is also known as MULTI-seq | |||
| The well maintained R platform is Seurat V3 | satijalab | https://satijalab.org/seurat/ | |
| TipOne RPT 0.1-10/20 ul XL ultra low retention filter pipet tip | USA Scientific | 1180-3710 | |
| TipOne RPT 1000 ul XL ultra low retention filter pipet tip | USA Scientific | 1182-1730 | |
| TipOne RPT 200 ul ultra low retention filter pipet tip | USA Scientific | 1180-8710 | |
| TotalSeq-A0301 anti-mouse Hashtag 1 Antibody | BioLegend | 155801 | 0.1 – 1.0 µg of antibody in 100 µl of staining buffer for every 1 million cells |
| TotalSeq-A0302 anti-mouse Hashtag 2 Antibody | BioLegend | 155803 | 0.1 – 1.0 µg of antibody in 100 µl of staining buffer for every 1 million cells |
| TotalSeq-A0302 anti-mouse Hashtag 3 Antibody | BioLegend | 155805 | 0.1 – 1.0 µg of antibody in 100 µl of staining buffer for every 1 million cells |
| TrueSeq RPI primer | Integrated DNA Technologies | Single-stranded DNA | 100 nmol, used in Lipid-tagged barcode library mix (Table 1) |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Fisher Scientific | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Fisher Scientific | 25200-056 | |
| Universal I5 | Integrated DNA Technologies | Single-stranded DNA | 100 nmol |
References
- Raj, A., Van Den Bogaard, P., Rifkin, S. A., Van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nature Methods. 5 (10), 877 (2008).
- Tang, F., et al. mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell. Nature Methods. 6 (5), 377 (2009).
- Li, G., Plonowska, K., Kuppusamy, R., Sturzu, A., Wu, S. M. Identification of cardiovascular lineage descendants at single-cell resolution. Development. 142 (5), 846-857 (2015).
- DeLaughter, D. M., et al. Single-cell resolution of temporal gene expression during heart development. Developmental Cell. 39 (4), 480-490 (2016).
- Li, G., et al. Single cell expression analysis reveals anatomical and cell cycle-dependent transcriptional shifts during heart development. Development. 146 (12), dev173476 (2019).
- Meilhac, S. M., Buckingham, M. E. The deployment of cell lineages that form the mammalian heart. Nature Reviews Cardiology. 1, (2018).
- Liu, Z., et al. Single-cell transcriptomics reconstructs fate conversion from fibroblast to cardiomyocyte. Nature. 551 (7678), 100 (2017).
- Lafzi, A., Moutinho, C., Picelli, S., Heyn, H. Tutorial: guidelines for the experimental design of single-cell RNA sequencing studies. Nature Protocols. 1, (2018).
- The Tabula Muris Consortium. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature. 562 (7727), 367 (2018).
- Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. Single-cell genome sequencing: current state of the science. Nature Reviews Genetics. 17 (3), 175 (2016).
- Grün, D., van Oudenaarden, A. Design and analysis of single-cell sequencing experiments. Cell. 163 (4), 799-810 (2015).
- Ziegenhain, C., et al. Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods. Molecular cell. 65 (4), 631-643 (2017).
- Hashimshony, T., et al. CEL-Seq2: sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq. Genome Biology. 17 (1), 77 (2016).
- Islam, S., et al. Characterization of the single-cell transcriptional landscape by highly multiplex RNA-seq. Genome Research. 21 (7), 1160-1167 (2011).
- Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
- Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
- . Library Prep -Single Cell Gene Expression -Official 10x Genomics Support Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/library-prep (2018)
- McGinnis, C. S., et al. MULTI-seq: sample multiplexing for single-cell RNA sequencing using lipid-tagged indices. Nature Methods. 1, (2019).
- Stoeckius, M., et al. Cell hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biology. 19 (1), 224 (2018).
- Chan, M. M., et al. Molecular recording of mammalian embryogenesis. Nature. 570 (7759), 77-82 (2019).
- . Agilent 4200 TapeStation System Available from: https://www.agilent.com/cs/library/datasheets/public/5991-6029EN.pdf (2019)
- . SPRIselect User Guide Available from: https://research.fhcrc.org/content/dam/stripe/hahn/methods/mol_biol/SPRIselect%20User%20Guide.pdf (2012)
- . Qubit 4 Fluorometer User Guide Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0017209_Qubit_4_Fluorometer_UG.pdf (2018)
- . Agilent High Sensitivity DNA Kit Guide Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/High%20Sensitivity_DNA_KG.pdf (2016)
- Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nature Biotechnology. 36 (5), 411 (2018).
- Weber, R. J., Liang, S. I., Selden, N. S., Desai, T. A., Gartner, Z. J. Efficient targeting of fatty-acid modified oligonucleotides to live cell membranes through stepwise assembly. Biomacromolecules. 15 (12), 4621-4626 (2014).
- . Single Cell Protocols Cell Preparation Guide Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep (2017)
