Multiplexed Single Cell mRNA Sequencing Analysis of Mouse Embryonic Cells

El perfil transcripcional de cada célula individual varía entre las poblaciones celulares durante el desarrollo embrionario. Aunque la hibridación molecular in situ única se puede utilizar para visualizar la expresión de un pequeño número de genes¹, la secuenciación de ARNm de una sola célula (scRNA-Seq) proporciona un enfoque imparcial para ilustrar los patrones de expresión de genes en todo el genoma en células individuales. Después de su publicación por primera vez en 2009², scRNA-Seq se ha aplicado para estudiar múltiples tejidos en múltiples etapas de desarrollo en los últimos años^3,4,5. Además, a medida que el atlas de células humanas ha lanzado recientemente sus proyectos centrados en el desarrollo, se espera que en un futuro próximo se generen más datos de células únicas de tejidos embrionarios humanos.

El corazón como el primer órgano en desarrollarse desempeña un papel crítico en el desarrollo embrionario. El corazón consta de varios tipos de células y el desarrollo de cada tipo de célula está estrechamente regulado temporal y espacialmente. En los últimos años, el origen y el linaje celular de las células cardíacas en las primeras etapas del desarrollo se han caracterizado^6,que proporcionan una tremenda herramienta de navegación útil para la comprensión de la patogénesis congénita de enfermedades cardíacas, así como para el desarrollo de métodos más tecnológicamente avanzados para estimular la regeneración de cardiomiocitos⁷.

El scRNA-Seq ha experimentado una rápida expansión en los últimos años^8,9,10. Con los métodos recién desarrollados, el diseño y análisis de experimentos de una sola célula se ha vuelto más alcanzable^11,12,13,14. El método presentado aquí es un procedimiento comercial basado en las soluciones de gotas (ver Tabla de Materiales)^15,16. Este método cuenta con la captura de células y conjuntos de cuentas con código de barras única en una gota de emulsión aceite-agua bajo el control de un sistema de controlador microfluídico. La velocidad de carga de celdas en las gotas es extremadamente baja, por lo que la mayoría de las emulsiones de gotas contienen solo una celda^17. El ingenioso diseño del procedimiento proviene de la separación de una sola célula en emulsiones de gotas que ocurren simultáneamente con la codificación de barras, lo que permite el análisis paralelo de células individuales utilizando ARN-Seq en una población heterogénea.

La incorporación de estrategias de multiplexación es una de las adiciones importantes al flujo de trabajo de una sola célula tradicional^13,14. Esta adición es muy útil para desechar los dobletes celulares, reducir los costos experimentales y eliminar los efectos por lotes^18,19. Una estrategia de codificación de barras basada en lípidos y una estrategia de codificación de barras basada en anticuerpos (ver Tabla de Materiales)son los dos métodos de multiplexación utilizados principalmente. Los códigos de barras específicos se utilizan para etiquetar cada muestra en ambos métodos, y las muestras etiquetadas se mezclan para la captura de una sola celda, la preparación de la biblioteca y la secuenciación. Después, los datos de secuenciación agrupados se pueden separar analizando las secuencias de códigos de barras (Figura 1)¹⁹. Sin embargo, existen diferencias significativas entre los dos métodos. La estrategia de codificación de barras basada en lípidos se basa en oligonucleótidos modificados con lípidos, que no se ha encontrado que tenga ninguna preferencia de tipo de célula. Mientras que la estrategia de codificación de barras basada en anticuerpos sólo puede detectar las células que expresan las proteínas antígeno^19,20. Además, se tarda unos 10 minutos en manchar los lípidos, pero 40 minutos para manchar los anticuerpos(Figura 1). Además, los oligonucleótidos modificados con lípidos son más baratos que los oligonucleótidos conjugados con anticuerpos, pero no están disponibles comercialmente en el momento de escribir este artículo. Por último, la estrategia basada en lípidos puede multiplexar 96 muestras en un solo experimento, pero la estrategia basada en anticuerpos actualmente solo puede multiplexar 12 muestras.

El número de celda recomendado para multiplexar en un solo experimento debe ser inferior a 2,5 x 10⁴, de lo contrario, conducirá a un alto porcentaje de dobletes celulares y una posible contaminación del ARNm ambiental. A través de las estrategias de multiplexación, el costo de captura de una sola célula, generación de ADNc y preparación de bibliotecas para múltiples muestras se reducirá al costo de una muestra, pero el costo de secuenciación seguirá siendo el mismo.