Analisi del sequenziamento dell'mRNA a cella singola multiplexed delle cellule embrionali del topo

Il profilo trascrizionale di ogni singola cellula varia tra le popolazioni cellulari durante lo sviluppo embrionale. Sebbene l’ibridazione molecolare singola in situ possa essere utilizzata per visualizzare l’espressione di un piccolo numero di geni¹, il sequenziamento dell’mRNA a singola cellula (scRNA-Seq) fornisce un approccio imparziale per illustrare i modelli di espressione dei geni a livello di genoma nei singoli geni. Dopo che è stato pubblicato per la prima volta nel 2009², scRNA-Seq è stato applicato per studiare più tessuti in più fasi di sviluppo negli ultimi anni^3,4,5. Inoltre, poiché l’atlante delle cellule umane ha recentemente lanciato i suoi progetti incentrati sullo sviluppo, si prevede che nel prossimo futuro saranno generati più dati di cellule singole provenienti da tessuti embrionali umani.

Il cuore come primo organo a svilupparsi svolge un ruolo critico nello sviluppo embrionale. Il cuore è costituito da più tipi di cellule e lo sviluppo di ogni tipo di cellula è strettamente regolato temporalmente e spazialemente. Negli ultimi anni, l’origine e il lignaggio cellulare delle cellule cardiache nelle fasi iniziali dello sviluppo sono state caratterizzate⁶, che forniscono un enorme strumento di navigazione utile per comprendere la patogenesi congenita delle malattie cardiache, nonché per sviluppare metodi più tecnologicamente avanzati per stimolare la rigenerazione cardiomiocita⁷.

Lo scRNA-Seq ha subito una rapida espansione negli ultimi anni^8,9,10. Con i metodi appena sviluppati, la progettazione e l’analisi di esperimenti a cella singola è diventato più realizzabile^11,12,13,14. Il metodo qui presentato è una procedura commerciale basata sulle soluzioni di gocciolina (vedi Tabella dei materiali)^15,16. Questo metodo è dotato di catturare celle e insiemi di perline codificate in modo univoco in una goccia di emulsione olio-acqua sotto il controllo di un sistema di controllo microfluidico. La velocità di caricamento delle celle nelle goccioline è estremamente bassa in modo che la maggior parte delle emulsioni delle goccioline contengano una sola cella¹⁷. L’ingegnoso design della procedura deriva dalla separazione di una singola cellula in emulsioni di goccioline che si verificano contemporaneamente con la codifica a barre, che consente l’analisi parallela di singole cellule utilizzando RNA-Seq su una popolazione eterogenea.

L’incorporazione di strategie di multiplexing è una delle aggiunte importanti al tradizionale flusso di lavoro a cella singola^13,14. Questa aggiunta è molto utile per eliminare i doppietti cellulari, ridurre i costi sperimentali ed eliminare gli effetti di lotto^18,19. Una strategia di codifica a barre basata su lipidi e una strategia di codifica a barre basata su anticorpi (vedi Tabella dei materiali) sono i due metodi di multiplexing per lo più utilizzati. I codici a barre specifici vengono utilizzati per etichettare ogni campione in entrambi i metodi e i campioni etichettati vengono quindi miscelati per l’acquisizione di una singola cella, la preparazione della libreria e la sequenza. Successivamente, i dati di sequenza in pool possono essere separati analizzando le sequenze di codici a barre (Figura 1)¹⁹. Tuttavia, esistono differenze significative tra i due metodi. La strategia di codifica a barre basata su lipidi si basa su oligonucleotidi modificati ai lipidi, che non è stato trovato per avere preferenze di tipo di cellula. Mentre la strategia di codifica a barre basata su anticorpi può rilevare solo le cellule che esprimono le proteine dell’antigene^19,20. Inoltre, ci vogliono circa 10 min per macchiare i lipidi ma 40 min per macchiare gli anticorpi (Figura 1). Inoltre, gli oligonucleotidi modificati dai lipidi sono più economici degli oligonucleotidi coniugati da anticorpi, ma non disponibili in commercio al momento della scrittura di questo articolo. Infine, la strategia basata sui lipidi può multiplex 96 campioni in un esperimento, ma la strategia basata su anticorpi attualmente può essere solo multiplex 12 campioni.

Il numero di cellule raccomandato al multiplex in un singolo esperimento dovrebbe essere inferiore a 2,5 x 10^4,altrimenti porterà a un’alta percentuale di doppietti cellulari e a una potenziale contaminazione da mRNA ambientali. Attraverso le strategie di multiplexing, il costo dell’acquisizione di una singola cella, della generazione di cDNA e della preparazione della libreria per più campioni sarà ridotto al costo di un campione, ma il costo di sequenziamento rimarrà lo stesso.