Multiplexed Single Cell mRNA Sequenzierungsanalyse von Mausembryonalzellen
Summary
Hier präsentierten wir eine multiplexierte einzellige mRNA-Sequenzierungsmethode, um die Genexpression in embryonalen Geweben der Maus zu profilieren. Die tropfenbasierte einzelzellbasierte mRNA-Sequenzierung (scRNA-Seq) in Kombination mit Multiplexing-Strategien kann Einzelne Zellen aus mehreren Proben gleichzeitig profilieren, was die Reagenzkosten deutlich reduziert und experimentelle Chargeneffekte minimiert.
Abstract
Die einzellige mRNA-Sequenzierung hat in den letzten Jahren erhebliche Fortschritte gemacht und ist zu einem wichtigen Instrument auf dem Gebiet der Entwicklungsbiologie geworden. Es wurde erfolgreich verwendet, um seltene Zellpopulationen zu identifizieren, neue Markergene zu entdecken und räumliche und zeitliche Entwicklungsinformationen zu entschlüsseln. Die Einzelzellmethode hat sich in den letzten zwei bis drei Jahren auch von der mikrofluidischen Fluidigm C1-Technologie zu den Tropfen-basierten Lösungen entwickelt. Hier haben wir das Herz als Beispiel verwendet, um zu zeigen, wie man die embryonalen Gewebezellen der Maus mit der tröpfchenbasierten scRNA-Seq-Methode profiliert. Darüber hinaus haben wir zwei Strategien in den Workflow integriert, um mehrere Samples in einem einzigen Experiment zu profilieren. Mit einer der integrierten Methoden haben wir gleichzeitig mehr als 9.000 Zellen aus acht Herzproben profiliert. Diese Methoden werden für den Bereich der Entwicklungsbiologie wertvoll sein, indem sie eine kostengünstige Möglichkeit bieten, einzelne Zellen aus unterschiedlichen genetischen Hintergründen, Entwicklungsstadien oder anatomischen Orten gleichzeitig zu profilieren.
Introduction
Das Transkriptionsprofil jeder einzelnen Zelle variiert zwischen den Zellpopulationen während der embryonalen Entwicklung. Obwohl die einzelne molekulare In-situ-Hybridisierung verwendet werden kann, um die Expression einer kleinen Anzahl von Genen1zu visualisieren, bietet die einzellige mRNA-Sequenzierung (scRNA-Seq) einen unvoreingenommenen Ansatz zur Veranschaulichung genomweiter Expressionsmuster von Genen in Einzelzellen. Nach der erstveröffentlichung im Jahr 20092wurde scRNA-Seq in den letzten Jahren zur Untersuchung mehrerer Gewebe in mehreren Entwicklungsstadienangewendet 3,4,5. Da der Atlas der menschlichen Zellen in jüngster Zeit seine entwicklungsorientierten Projekte gestartet hat, werden in naher Zukunft weitere Einzelzelldaten aus menschlichen embryonalen Geweben erwartet.
Das Herz als erstes Organ, das sich entwickelt, spielt eine entscheidende Rolle bei der embryonalen Entwicklung. Das Herz besteht aus mehreren Zelltypen und die Entwicklung jedes Zelltyps ist zeitlich und räumlich streng reguliert. In den letzten Jahren wurden der Ursprung und die Zellabstammung von Herzzellen in frühen Entwicklungsstadien charakterisiert6, die ein enormes nützliches Navigationswerkzeug für das Verständnis der angeborenen Krankheitspathogenese bieten, sowie für die Entwicklung technologisch fortschrittlicherer Methoden zur Stimulierung der Kardiomyozytenregeneration7.
Der scRNA-Seq hat sich in den letzten Jahren rasant erweitert8,9,10. Mit den neu entwickelten Methoden ist design und analysis of single cell experiments um11,12,13,14erreichbarer geworden. Die hier vorgestellte Methode ist ein kommerzielles Verfahren, das auf den Tröpfchenlösungen basiert (siehe Materialtabelle)15,16. Diese Methode verfügt über die Erfassung von Zellen und Sets von eindeutig barcoded Perlen in einem Öl-Wasser-Emulsionströpfchen unter der Kontrolle eines mikrofluidischen Steuerungssystems. Die Rate der Zellbelastung in die Tröpfchen ist extrem niedrig, so dass die Mehrheit der Tröpfchenemulsionen nur eine Zelle17enthält. Das ausgeklügelte Design des Verfahrens ergibt sich aus der Einzelzelltrennung in Tröpfchenemulsionen, die gleichzeitig mit Barcoding auftreten, was die parallele Analyse einzelner Zellen mit RNA-Seq an einer heterogenen Population ermöglicht.
Die Integration von Multiplexing-Strategien ist eine der wichtigen Ergänzungen des traditionellen Einzelzell-Workflows13,14. Diese Ergänzung ist sehr nützlich, um Zelldoublets zu verwerfen, die experimentellen Kosten zu senken und Batcheffekte zu eliminieren18,19. Eine lipidbasierte Barcoding-Strategie und eine Antikörper-basierte Barcoding-Strategie (siehe Tabelle der Materialien) sind die beiden meist verwendeten Multiplexing-Methoden. Bestimmte Barcodes werden verwendet, um jedes Beispiel in beiden Methoden zu beschriften, und die beschrifteten Proben werden dann für die Einzelzellenerfassung, Bibliotheksvorbereitung und Sequenzierung gemischt. Anschließend können die gepoolten Sequenzierungsdaten durch Analyse der Barcodesequenzen getrennt werden (Abbildung 1)19. Zwischen den beiden Methoden bestehen jedoch erhebliche Unterschiede. Die lipidbasierte Barcoding-Strategie basiert auf lipidmodifizierten Oligonukleotiden, die keine Zelltyppräferenzen haben. Während die Antikörper-basierte Barcoding-Strategie kann nur die Zellen, die die Antigen-Proteine19,20. Darüber hinaus dauert es etwa 10 min, um die Lipide zu färben, aber 40 min, um die Antikörper zu färben (Abbildung 1). Darüber hinaus sind die lipidmodifizierten Oligonukleotide billiger als antikörperkonjugierte Oligonukleotide, aber zum Zeitpunkt des Schreibens dieses Artikels nicht kommerziell erhältlich. Schließlich kann die Lipid-basierte Strategie 96-Proben in einem Experiment multiplexen, aber die Antikörper-basierte Strategie kann derzeit nur Multiplex 12 Proben.
Die empfohlene Zellzahl zum Multiplex in einem einzigen Experiment sollte niedriger als 2,5 x 104sein, da sie andernfalls zu einem hohen Anteil an Zelldoublets und einer potenziellen mRNA-Kontamination in der Umgebung führt. Durch die Multiplexing-Strategien werden die Kosten für die Einzelzellerfassung, cDNA-Generierung und Bibliotheksvorbereitung für mehrere Samples auf die Kosten für eine Probe reduziert, aber die Sequenzierungskosten bleiben gleich.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dieser Studie haben wir ein Protokoll zur Analyse von einzelzelligen Transkriptionsprofilen demonstriert. Wir haben auch zwei optionale Methoden für Multiplex-Proben im scRNA-Seq-Workflow bereitgestellt. Beide Methoden haben sich in verschiedenen Labors als machbar erwiesen und Lösungen für ein kostengünstiges und batcheffektfreies Einzelzellexperiment18,26geliefert.
Es gibt ein paar Schritte, die sorgfältig befolgt werden soll…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken David M. Patterson und Christopher S. McGinnis vom Labor Dr. Zev J. Gartner für ihre Art und Weise der Bereitstellung der lipidbasierten Barcoding-Reagenzien und Vorschläge zu den experimentellen Schritten und der Datenanalyse. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (HL13347202) gegründet.
Materials
| 10% Tween-20 | Bio-Rad | 1610781 | |
| 10x Chip Holder | 10x Genomics | 120252 330019 | |
| 10x Chromium Controller | 10x Genomics | 120223 | |
| 10x Magnetic Separator | 10x Genomics | 120250 230003 | |
| 10x Vortex Adapter | 10x Genomics | 330002, 120251 | |
| 10x Vortex Clip | 10x Genomics | 120253 230002 | |
| 4200 TapeStation System | Agilent | G2991AA | |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | University of Pittsburgh Health Sciences Sequencing Core |
| Barcode Oligo | Integrated DNA Technologies | Single-stranded DNA | 25 nmol |
| Buffer EB | Qiagen | 19086 | |
| CD1 mice | Chales River | Strain Code 022 | ordered pregnant mice |
| Centrifuge 5424R | Appendorf | 2231000214 | |
| Chromium Chip B Single Cell Kit, 48 rxns | 10x Genomics | 1000073 | Store at ambient temperature |
| Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns | 10x Genomics | 120262 | Store at -20 °C |
| Chromium Single Cell 3' GEM Kit v3,4 rxns | 10x Genomics | 1000094 | Store at -20 °C |
| Chromium Single Cell 3' Library Kit v3 | 10x Genomics | 1000095 | Store at -20 °C |
| Chromium Single Cell 3' v3 Gel Beads | 10x Genomics | 2000059 | Store at -80 °C |
| Collagenase A | Sigma/Millipore | 10103578001 | Store powder at 4 °C, store at -20 °C after it dissolves |
| Collagenase B | Sigma/Millipore | 11088807001 | Store powder at 4 °C, store at -20 °C after it dissolves |
| D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5582 | University of Pittsburgh Health Sciences Sequencing Core |
| DNA LoBind Tube Microcentrifuge Tube, 1.5 mL | Eppendorf | 022431021 | |
| DNA LoBind Tube Microcentrifuge Tube, 2.0 mL | Eppendorf | 022431048 | |
| Dynabeads MyOne SILANE | 10x Genomics | 2000048 | Store at 4 °C, used in Beads Cleanup Mix (Table 1) |
| DynaMag-2 Magnet | Theromo Scientific | 12321D | |
| Ethanol, Pure (200 Proof, anhydrous) | Sigma | E7023-500mL | |
| Falcon 15mL High Clarity PP Centrifuge Tube | Corning Cellgro | 14-959-70C | |
| Falcon 50mL High Clarity PP Centrifuge Tube | Corning Cellgro | 14-959-49A | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, United States | Fisher Scientific | 26140079 | Store at -20 °C |
| Finnpipette F1 Multichannel Pipettes, 10-100μl | Theromo Scientific | 4661020N | |
| Finnpipette F1 Multichannel Pipettes, 1-10μl | Theromo Scientific | 4661000N | |
| Flowmi Cell Strainer | Sigma | BAH136800040 | Porosity 40 μm, for 1000 uL Pipette Tips, pack of 50 each |
| Glycerin (Glycerol), 50% (v/v) | Ricca Chemical Company | 3290-32 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14170112 | |
| Human TruStain FcX (Fc Receptor Blocking Solution) | BioLegend | 422301 | Add 5 µl of Human TruStain FcX per million cells in 100 µl staining volume |
| Isopropanol (IPA) | Fisher Scientific | A464-4 | |
| Kapa HiFi HotStart ReadyMix (2X) | Fisher Scientific | NC0295239 | Store at -20 °C, used in Lipid-tagged barcode library mix (Table 1) |
| Lipid Barcode Primer (Multi-seq Primer) | Integrated DNA Technologies | Single-stranded DNA | 100 nmol |
| Low TE Buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1 mM EDTA) | Thermo Fisher Scientific | 12090-015 | |
| MasterCycler Pro | Eppendorf | 950W | |
| Nuclease-Free Water (Ambion) | Thermo Fisher Scientific | AM9937 | |
| PCR Tubes 0.2 ml 8-tube strips | Eppendorf | 951010022 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) 1X without calcium & magnesium | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) with 10% Bovine Albumin (alternative to Thermo Fisher product) | Sigma-Aldrich | SRE0036 | |
| Pipet 4-pack (0.1–2.5μL, 0.5-10μL, 10–100μL, 100–1,000μL variable-volume pipettes | Fisher Scientific | 05-403-151 | |
| Selection reagent (SPRIselect Reagent Kit) | Beckman Coulter | B23318 (60ml) | |
| Template Switch Oligo | 10x Genomics | 3000228 | Store at -20 °C, used in Master Mix (Table 1) |
| The antibody based barcoding strategy is also known as Cell Hashing | |||
| The cell browser is Loup Cell Browser | 10x Genomics | https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/visualization/latest/what-is-loupe-cell-browser | |
| The commercial available analysis pipline in step 8.1 is Cell Ranger | 10x Genomics | https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger | |
| The lipid based barcoding strategy is also known as MULTI-seq | |||
| The well maintained R platform is Seurat V3 | satijalab | https://satijalab.org/seurat/ | |
| TipOne RPT 0.1-10/20 ul XL ultra low retention filter pipet tip | USA Scientific | 1180-3710 | |
| TipOne RPT 1000 ul XL ultra low retention filter pipet tip | USA Scientific | 1182-1730 | |
| TipOne RPT 200 ul ultra low retention filter pipet tip | USA Scientific | 1180-8710 | |
| TotalSeq-A0301 anti-mouse Hashtag 1 Antibody | BioLegend | 155801 | 0.1 – 1.0 µg of antibody in 100 µl of staining buffer for every 1 million cells |
| TotalSeq-A0302 anti-mouse Hashtag 2 Antibody | BioLegend | 155803 | 0.1 – 1.0 µg of antibody in 100 µl of staining buffer for every 1 million cells |
| TotalSeq-A0302 anti-mouse Hashtag 3 Antibody | BioLegend | 155805 | 0.1 – 1.0 µg of antibody in 100 µl of staining buffer for every 1 million cells |
| TrueSeq RPI primer | Integrated DNA Technologies | Single-stranded DNA | 100 nmol, used in Lipid-tagged barcode library mix (Table 1) |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Fisher Scientific | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Fisher Scientific | 25200-056 | |
| Universal I5 | Integrated DNA Technologies | Single-stranded DNA | 100 nmol |
References
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