Analyse du séquençage de l'ARNm à cellule unique multiplexée des cellules embryonnaires de souris

Le profil transcriptionnel de chaque cellule varie selon les populations cellulaires au cours du développement embryonnaire. Bien que l’hybridation moléculaire in situ unique puisse être utilisée pour visualiser l’expression d’un petit nombre de gènes¹, le séquençage de l’ARNm à cellule unique (scRNA-Seq) fournit une approche impartiale pour illustrer les modèles d’expression à l’échelle du génome des gènes dans les cellules individuelles. Après sa première publication en 2009², scRNA-Seq a été appliqué pour étudier plusieurs tissus à plusieurs stades de développement au cours des dernières années^3,4,5. De plus, comme l’atlas des cellules humaines a lancé récemment ses projets axés sur le développement, on s’attend à ce que davantage de données sur les cellules individuelles provenant de tissus embryonnaires humains soient générées dans un proche avenir.

Le cœur en tant que premier organe à se développer joue un rôle critique dans le développement embryonnaire. Le cœur se compose de plusieurs types de cellules et le développement de chaque type de cellule est étroitement réglementé temporellement et spatialement. Au cours des dernières années, l’origine et la lignée cellulaire des cellules cardiaques aux premiers stades de développement ont été caractérisées⁶, qui fournissent un outil de navigation extrêmement utile pour comprendre la pathogénie congénitale des maladies cardiaques, ainsi que pour le développement de méthodes plus avancées technologiquement pour stimuler la régénération cardiomyocyte⁷.

Le scRNA-Seq a subi une expansion rapide ces dernières années^8,9,10. Avec les méthodes nouvellement développées, la conception et l’analyse des expériences à cellule unique est devenue plus réalisable^11,12,13,14. La méthode présentée ici est une procédure commerciale basée sur les solutions droplet (voir Tableau des Matériaux)^15,16. Cette méthode consiste à capturer des cellules et des ensembles de perles codées à barres uniques dans une gouttelette d’émulsion d’huile-eau sous le contrôle d’un système de contrôleur microfluidique. Le taux de chargement cellulaire dans les gouttelettes est extrêmement faible de sorte que la majorité des émulsions de gouttelettes ne contiennent qu’une seule cellule¹⁷. La conception ingénieuse de la procédure provient de la séparation d’une seule cellule en émulsions de gouttelettes se produisant simultanément avec le codage à barres, qui permet l’analyse parallèle des cellules individuelles utilisant l’ARN-Seq sur une population hétérogène.

L’incorporation de stratégies de multiplexage est l’un des ajouts importants au flux de travail traditionnel à cellule unique^13,14. Cet ajout est très utile dans le rejet des doublets cellulaires, la réduction des coûts expérimentaux, et l’élimination des effets de lot^18,19. Une stratégie de codage à barres basée sur les lipides et une stratégie de codage à barres à base d’anticorps (voir Tableau des matériaux) sont les deux méthodes de multiplexage principalement utilisées. Des codes-barres spécifiques sont utilisés pour étiqueter chaque échantillon dans les deux méthodes, et les échantillons étiquetés sont ensuite mélangés pour la capture d’une seule cellule, la préparation de la bibliothèque et le séquençage. Par la suite, les données de séquençage mises en commun peuvent être séparées en analysant les séquences de codes à barres (Figure 1)¹⁹. Cependant, des différences significatives existent entre les deux méthodes. La stratégie de codage à barres à base de lipides est basée sur des oligonucléotides modifiés par les lipides, qui n’ont pas eu de préférences de type cellulaire. Alors que la stratégie de codage à barres à base d’anticorps ne peut détecter que les cellules exprimant les protéines d’antigène^19,20. En outre, il faut environ 10 min pour tacher les lipides, mais 40 min pour tacher les anticorps (Figure 1). En outre, les oligonucléotides lipides modifiés sont moins chers que les oligonucléotides conjugués aux anticorps, mais ne sont pas disponibles dans le commerce au moment de la rédaction de cet article. Enfin, la stratégie à base de lipides peut multiplex96 échantillons dans une expérience, mais la stratégie basée sur les anticorps ne peut actuellement multiplex 12 échantillons.

Le nombre de cellules recommandée au multiplexe dans une seule expérience devrait être inférieur à 2,5 x 10⁴, sinon, il conduira à un pourcentage élevé de doublets cellulaires et la contamination potentielle de l’ARNm ambiant. Grâce aux stratégies de multiplexage, le coût de la capture d’une seule cellule, de la production d’ADNc et de la préparation de plusieurs échantillons sera réduit au coût d’un échantillon, mais le coût de séquençage demeurera le même.