مولتيميد خليه واحده mRNA تحليل التسلسل من الخلايا الجنينية الماوس
Summary
هنا قدمنا مضاعفه خليه واحده mRNA أسلوب التسلسل إلى التعبير الجيني الشخصي في الانسجه الجنينية الماوس. الخلية المفردة القائمة علي القطرات mRNA التسلسل (scRNA-Seq) الأسلوب في تركيبه مع استراتيجيات تعدد الإرسال يمكن الملفات الشخصية خلايا واحده من عينات متعددة في وقت واحد ، مما يقلل بشكل كبير من تكاليف الكاشف ويقلل من اثار الدفعة التجريبية.
Abstract
وقد أحرز التسلسل التسلسلي للخلية الواحدة تقدما كبيرا في السنوات العديدة الماضية وأصبح أداه هامه في مجال البيولوجيا التنموية. وقد استخدمت بنجاح لتحديد السكان الخلايا النادرة ، واكتشاف الجينات علامة الرواية ، وفك المعلومات التنموية المكانية والزمانيه. وقد تطورت طريقه الخلية الواحدة أيضا من تكنولوجيا Fluidigm C1 المستندة إلى ميكروفلوديميك إلى الحلول القائمة علي القطرات في السنتين أو الثلاث سنوات الماضية. هنا استخدمنا القلب كمثال لشرح كيفيه التعريف خلايا الانسجه الجنينية الماوس باستخدام الطريقة التي تستند إلى القطرة scRNA-Seq. الاضافه إلى ذلك ، قمنا بدمج استراتيجيتين في سير العمل لتشكيل عينات متعددة في تجربه واحده. باستخدام واحده من الأساليب المتكاملة ، لدينا في وقت واحد لمحه أكثر من 9,000 خلايا من عينات القلب ثمانيه. ستكون هذه الأساليب ذات قيمه لمجال البيولوجيا التنموية من خلال توفير طريقه فعاله من حيث التكلفة لتشكيل خلايا منفردة في ان واحد من خلفيات وراثيه مختلفه أو مراحل تنموية أو مواقع تشريحيه.
Introduction
ويختلف الملف التعريفي لكل خليه من خلايا الخلية الواحدة بين مجموعات الخلايا اثناء النمو الجنيني. علي الرغم من ان التهجين الجزيئي الواحد في الموقع يمكن استخدامه لتصور التعبير عن عدد صغير من الجينات1، فان تسلسل الخلايا الاحاديه الخلية (Scrna-Seq) يوفر نهجا غير متحيز لتوضيح أنماط التعبير علي نطاق الجينوم للجينات في الخلايا المفردة. بعد نشرها لأول مره في 20092، تم تطبيق scrna-Seq لدراسة الانسجه المتعددة في مراحل تنموية متعددة في السنوات الاخيره3،4،5. كما انه نظرا لان أطلس الخلايا البشرية قد أطلق مؤخرا مشاريعه التي تركز علي التنمية ، فمن المتوقع ان تتولد في المستقبل القريب بيانات أكثر من خليه واحده من الانسجه الجنينية البشرية.
يلعب القلب كالجهاز اولي ان يطور دور حاسمه في تطوير جنينيه. يتالف القلب من يتعدد خليه أنواع والتطوير من كل خليه نوع يكون باحكام ينظم وقتيا و [سبتيلي]. علي مدي السنوات القليلة الماضية ، وقد تميزت سلاله المنشا والخلية من خلايا القلب في مراحل النمو المبكر6، والتي توفر أداه الملاحة مفيده هائله لفهم المسببة للامراض القلب الخلقية ، وكذلك لتطوير أساليب أكثر تقدما من الناحية التكنولوجية لتحفيز التجدد عضله7.
خضع ال [سكرنا-تلي] توسع سريعة في سنون أخيره8,9,10. مع الأساليب التي تم تطويرها حديثا ، وتصميم وتحليل التجارب خليه واحده أصبحت أكثر قابليه للتحقيق11،12،13،14. الطريقة المعروضة هنا هي اجراء تجاري يستند إلى حلول الحبريه (انظر جدول المواد)15,16. هذه الطريقة ميزات التقاط الخلايا ومجموعات من الخرز المرمزة بشكل فريد في قطره مستحلب زيت الماء تحت السيطرة علي نظام تحكم ميكروفلويدريك. معدل تحميل الخلية في قطرات منخفضه للغاية بحيث الغالبية العظمي من المستحلبات الحبريه تحتوي علي خليه واحده فقط17. وياتي التصميم البارع للاجراء من فصل الخلايا الواحدة إلى المستحلبات التجميعية التي تحدث في وقت واحد مع الترميز ، والتي تمكن التحليل الموازي للخلايا الفردية باستخدام الحمض الريبي-المتسلسل علي السكان غير المتجانسين.
دمج استراتيجيات تعدد الإرسال هي واحده من الإضافات الهامه لسير العمل التقليدية خليه واحده13,14. هذه الاضافه مفيده جدا في التخلص من الشكوك الخلية ، والحد من التكاليف التجريبية ، والقضاء علي اثار الدفعات18،19. استراتيجية الترميز القائم علي الدهن واستراتيجية الترميز المضادة القائمة علي الأضداد (انظر جدول المواد) هي الطريقتين الأكثر استخداما لتعدد الإرسال. تستخدم الباركود المحددة لتسميه كل عينه في كلا الأسلوبين ، ومن ثم يتم خلط العينات المسمية للتقاط خليه واحده ، واعداد المكتبة ، والتسلسل. بعد ذلك ، يمكن فصل بيانات التسلسل المجمع عن طريق تحليل تسلسلات الباركود (الشكل 1)19. ومع ذلك ، توجد اختلافات كبيره بين الطريقتين. وتستند استراتيجية الترميز القائم علي الدهن علي الدهون المعدلة قله الكريات التي لم يتم العثور علي اي تفضيلات نوع الخلية. في حين ان الأجسام المضادة القائمة علي استراتيجية الترميز يمكن فقط الكشف عن الخلايا التي تعبر عن البروتينات مستضد19,20. الاضافه إلى ذلك ، فانه ياخذ حوالي 10 دقيقه لتلطيخ الدهون ولكن 40 دقيقه لوصمه عار الأجسام المضادة (الشكل 1). وعلاوة علي ذلك ، فان قله الكريات الدهنية المعدلة بالدهن أرخص من الأجسام المضادة-قله الكريات الوحيدة المترافقة ولكنها ليست متاحه تجاريا في وقت كتابه هذه المقالة. وأخيرا ، يمكن للاستراتيجية القائمة علي الدهن تعدد العينات 96 في تجربه واحده ، ولكن الاستراتيجية القائمة علي الأجسام المضادة لا يمكن حاليا الا تعدد 12 عينات.
يجب ان يكون رقم الخلية الموصي بها لتعدد الإرسال في تجربه واحده اقل من 2.5 × 104، والا ، فانه سيؤدي إلى نسبه عاليه من الشكوك الخلية والتلوث mrna المحيطة المحتملة. من خلال استراتيجيات تعدد الإرسال ، سيتم تخفيض تكلفه التقاط خليه واحده ، وجيل cDNA ، واعداد المكتبة لعينات متعددة إلى تكلفه عينه واحده ولكن تكلفه التسلسل ستبقي هي نفسها.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه الدراسة ، وقد أظهرنا بروتوكول لتحليل الملفات الشخصية الاحاديه الخلية. كما قدمنا طريقتين اختياريه لعينات متعددة الإرسال في سير العمل المتسلسل scRNA. وقد ثبت ان كلا الأسلوبين ممكنة في مختبرات مختلفه وقدمت حلولا لتشغيل تجربه خليه واحده فعاله من حيث التكلفة وخاليه من التاثير الدفعي<sup clas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر ديفيد م. باترسون وكريستوفر س. ماجينس من مختبر الدكتور زيف غارتنر لتوريدها النوع من الكواشف الشفرة القائمة علي الدهن واقتراحات بشان الخطوات التجريبية وتحليل البيانات. تاسست هذه الاعمال من قبل المعاهد الوطنية للصحة (HL13347202).
Materials
| 10% Tween-20 | Bio-Rad | 1610781 | |
| 10x Chip Holder | 10x Genomics | 120252 330019 | |
| 10x Chromium Controller | 10x Genomics | 120223 | |
| 10x Magnetic Separator | 10x Genomics | 120250 230003 | |
| 10x Vortex Adapter | 10x Genomics | 330002, 120251 | |
| 10x Vortex Clip | 10x Genomics | 120253 230002 | |
| 4200 TapeStation System | Agilent | G2991AA | |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | University of Pittsburgh Health Sciences Sequencing Core |
| Barcode Oligo | Integrated DNA Technologies | Single-stranded DNA | 25 nmol |
| Buffer EB | Qiagen | 19086 | |
| CD1 mice | Chales River | Strain Code 022 | ordered pregnant mice |
| Centrifuge 5424R | Appendorf | 2231000214 | |
| Chromium Chip B Single Cell Kit, 48 rxns | 10x Genomics | 1000073 | Store at ambient temperature |
| Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns | 10x Genomics | 120262 | Store at -20 °C |
| Chromium Single Cell 3' GEM Kit v3,4 rxns | 10x Genomics | 1000094 | Store at -20 °C |
| Chromium Single Cell 3' Library Kit v3 | 10x Genomics | 1000095 | Store at -20 °C |
| Chromium Single Cell 3' v3 Gel Beads | 10x Genomics | 2000059 | Store at -80 °C |
| Collagenase A | Sigma/Millipore | 10103578001 | Store powder at 4 °C, store at -20 °C after it dissolves |
| Collagenase B | Sigma/Millipore | 11088807001 | Store powder at 4 °C, store at -20 °C after it dissolves |
| D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5582 | University of Pittsburgh Health Sciences Sequencing Core |
| DNA LoBind Tube Microcentrifuge Tube, 1.5 mL | Eppendorf | 022431021 | |
| DNA LoBind Tube Microcentrifuge Tube, 2.0 mL | Eppendorf | 022431048 | |
| Dynabeads MyOne SILANE | 10x Genomics | 2000048 | Store at 4 °C, used in Beads Cleanup Mix (Table 1) |
| DynaMag-2 Magnet | Theromo Scientific | 12321D | |
| Ethanol, Pure (200 Proof, anhydrous) | Sigma | E7023-500mL | |
| Falcon 15mL High Clarity PP Centrifuge Tube | Corning Cellgro | 14-959-70C | |
| Falcon 50mL High Clarity PP Centrifuge Tube | Corning Cellgro | 14-959-49A | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, United States | Fisher Scientific | 26140079 | Store at -20 °C |
| Finnpipette F1 Multichannel Pipettes, 10-100μl | Theromo Scientific | 4661020N | |
| Finnpipette F1 Multichannel Pipettes, 1-10μl | Theromo Scientific | 4661000N | |
| Flowmi Cell Strainer | Sigma | BAH136800040 | Porosity 40 μm, for 1000 uL Pipette Tips, pack of 50 each |
| Glycerin (Glycerol), 50% (v/v) | Ricca Chemical Company | 3290-32 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14170112 | |
| Human TruStain FcX (Fc Receptor Blocking Solution) | BioLegend | 422301 | Add 5 µl of Human TruStain FcX per million cells in 100 µl staining volume |
| Isopropanol (IPA) | Fisher Scientific | A464-4 | |
| Kapa HiFi HotStart ReadyMix (2X) | Fisher Scientific | NC0295239 | Store at -20 °C, used in Lipid-tagged barcode library mix (Table 1) |
| Lipid Barcode Primer (Multi-seq Primer) | Integrated DNA Technologies | Single-stranded DNA | 100 nmol |
| Low TE Buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1 mM EDTA) | Thermo Fisher Scientific | 12090-015 | |
| MasterCycler Pro | Eppendorf | 950W | |
| Nuclease-Free Water (Ambion) | Thermo Fisher Scientific | AM9937 | |
| PCR Tubes 0.2 ml 8-tube strips | Eppendorf | 951010022 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) 1X without calcium & magnesium | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) with 10% Bovine Albumin (alternative to Thermo Fisher product) | Sigma-Aldrich | SRE0036 | |
| Pipet 4-pack (0.1–2.5μL, 0.5-10μL, 10–100μL, 100–1,000μL variable-volume pipettes | Fisher Scientific | 05-403-151 | |
| Selection reagent (SPRIselect Reagent Kit) | Beckman Coulter | B23318 (60ml) | |
| Template Switch Oligo | 10x Genomics | 3000228 | Store at -20 °C, used in Master Mix (Table 1) |
| The antibody based barcoding strategy is also known as Cell Hashing | |||
| The cell browser is Loup Cell Browser | 10x Genomics | https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/visualization/latest/what-is-loupe-cell-browser | |
| The commercial available analysis pipline in step 8.1 is Cell Ranger | 10x Genomics | https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger | |
| The lipid based barcoding strategy is also known as MULTI-seq | |||
| The well maintained R platform is Seurat V3 | satijalab | https://satijalab.org/seurat/ | |
| TipOne RPT 0.1-10/20 ul XL ultra low retention filter pipet tip | USA Scientific | 1180-3710 | |
| TipOne RPT 1000 ul XL ultra low retention filter pipet tip | USA Scientific | 1182-1730 | |
| TipOne RPT 200 ul ultra low retention filter pipet tip | USA Scientific | 1180-8710 | |
| TotalSeq-A0301 anti-mouse Hashtag 1 Antibody | BioLegend | 155801 | 0.1 – 1.0 µg of antibody in 100 µl of staining buffer for every 1 million cells |
| TotalSeq-A0302 anti-mouse Hashtag 2 Antibody | BioLegend | 155803 | 0.1 – 1.0 µg of antibody in 100 µl of staining buffer for every 1 million cells |
| TotalSeq-A0302 anti-mouse Hashtag 3 Antibody | BioLegend | 155805 | 0.1 – 1.0 µg of antibody in 100 µl of staining buffer for every 1 million cells |
| TrueSeq RPI primer | Integrated DNA Technologies | Single-stranded DNA | 100 nmol, used in Lipid-tagged barcode library mix (Table 1) |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Fisher Scientific | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Fisher Scientific | 25200-056 | |
| Universal I5 | Integrated DNA Technologies | Single-stranded DNA | 100 nmol |
References
- Raj, A., Van Den Bogaard, P., Rifkin, S. A., Van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nature Methods. 5 (10), 877 (2008).
- Tang, F., et al. mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell. Nature Methods. 6 (5), 377 (2009).
- Li, G., Plonowska, K., Kuppusamy, R., Sturzu, A., Wu, S. M. Identification of cardiovascular lineage descendants at single-cell resolution. Development. 142 (5), 846-857 (2015).
- DeLaughter, D. M., et al. Single-cell resolution of temporal gene expression during heart development. Developmental Cell. 39 (4), 480-490 (2016).
- Li, G., et al. Single cell expression analysis reveals anatomical and cell cycle-dependent transcriptional shifts during heart development. Development. 146 (12), dev173476 (2019).
- Meilhac, S. M., Buckingham, M. E. The deployment of cell lineages that form the mammalian heart. Nature Reviews Cardiology. 1, (2018).
- Liu, Z., et al. Single-cell transcriptomics reconstructs fate conversion from fibroblast to cardiomyocyte. Nature. 551 (7678), 100 (2017).
- Lafzi, A., Moutinho, C., Picelli, S., Heyn, H. Tutorial: guidelines for the experimental design of single-cell RNA sequencing studies. Nature Protocols. 1, (2018).
- The Tabula Muris Consortium. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature. 562 (7727), 367 (2018).
- Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. Single-cell genome sequencing: current state of the science. Nature Reviews Genetics. 17 (3), 175 (2016).
- Grün, D., van Oudenaarden, A. Design and analysis of single-cell sequencing experiments. Cell. 163 (4), 799-810 (2015).
- Ziegenhain, C., et al. Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods. Molecular cell. 65 (4), 631-643 (2017).
- Hashimshony, T., et al. CEL-Seq2: sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq. Genome Biology. 17 (1), 77 (2016).
- Islam, S., et al. Characterization of the single-cell transcriptional landscape by highly multiplex RNA-seq. Genome Research. 21 (7), 1160-1167 (2011).
- Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
- Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
- . Library Prep -Single Cell Gene Expression -Official 10x Genomics Support Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/library-prep (2018)
- McGinnis, C. S., et al. MULTI-seq: sample multiplexing for single-cell RNA sequencing using lipid-tagged indices. Nature Methods. 1, (2019).
- Stoeckius, M., et al. Cell hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biology. 19 (1), 224 (2018).
- Chan, M. M., et al. Molecular recording of mammalian embryogenesis. Nature. 570 (7759), 77-82 (2019).
- . Agilent 4200 TapeStation System Available from: https://www.agilent.com/cs/library/datasheets/public/5991-6029EN.pdf (2019)
- . SPRIselect User Guide Available from: https://research.fhcrc.org/content/dam/stripe/hahn/methods/mol_biol/SPRIselect%20User%20Guide.pdf (2012)
- . Qubit 4 Fluorometer User Guide Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0017209_Qubit_4_Fluorometer_UG.pdf (2018)
- . Agilent High Sensitivity DNA Kit Guide Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/High%20Sensitivity_DNA_KG.pdf (2016)
- Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nature Biotechnology. 36 (5), 411 (2018).
- Weber, R. J., Liang, S. I., Selden, N. S., Desai, T. A., Gartner, Z. J. Efficient targeting of fatty-acid modified oligonucleotides to live cell membranes through stepwise assembly. Biomacromolecules. 15 (12), 4621-4626 (2014).
- . Single Cell Protocols Cell Preparation Guide Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep (2017)
