固形腫瘍の予知免疫モデリング

ここに示す代表的な結果で利用されたヒト組織サンプルは、評判の良いエンティティ(TriStarテクノロジーグループ)から購入され、学術的および商業的研究を可能にするドナーの同意を得ただけでなく、有能な倫理からの承認を得ました委員 会。 パート I: プリキャプチャ ライブラリの準備 1. RNAの定量と資格 フルオロメトリックアッセイを用いてRNAを定量し、アッセイへの適切な入力を決定する。電気泳動を使用して入力 RNA の品質を評価し、RNA インテグリティ数 (RIN) とフラグメントの割合を決定 > 200 ヌクレオチド (DV200)値。 インタクト(RIN > 7)または部分的に分解されたRNAサンプル(RIN = 2〜7)の場合は、ステップ2.1から始めて、高品質/インタクトRNAのライブラリ調製手順に従います。RNAの品質は、サーマルサイクラープログラム#1(補足表2)で正しい断片化時間を選択するために重要です。 非常に劣化したサンプル(例えば、RIN = 1〜2またはFFPE)の場合、DV200値を決定します。これらのサンプルは断片化を必要とせず、ステップ 2.2 から始まる分解 RNA の指示に従います。 20 ng の RNA (高品質/インタクト RNA と RIN > 2) または 40 ng の RNA (DV 200 で分解/FFPE RNA を20%で) を希釈して、各サンプルのサンプルの適切な量の RNA を準備します。ヌクレアーゼフリー水で5μLに。DV200 < 20% でサンプルを処理することはお勧めしません。キットに付属のコントロールRNAサンプルの場合、適切なRNAの1μLをヌクレアーゼフリー水の4μLで希釈します。コントロールサンプルは、標識された高品質(Intact)または分解(FFPE)RNA材料に関して記述されたのと同じ処理に従います。キットに含まれるすべての試薬については、補足表 1を参照してください。 2. RNAの断片化とプライミング RIN > 2 で高品質/インタクト RNA を使用する場合は、ステップ 2.1.1 に従ってください。 高品質なRNAの場合、表1に従って、ヌクレアーゼフリーPCRチューブで氷上で断片化およびプライミング反応を組み立てます。 数回上下にピペットで混ぜ合わせます。その後、マイクロ遠心分離機でサンプルを短時間スピンダウンします。注: プロトコルのすべての遠心回転では、最低 3 s の場合は 1,000 x g以上の速度が推奨されます。 サンプルをサーマルサイクラーに入れ、プログラム#1 (補足表 2)を使用します。 すぐにチューブを氷に移し、高品質RNA用の第1鎖cDNA合成に進みます(ステップ3.1)。高品質と FFPE RNA の両方の同時準備のために、断片化インキュベーション中に FFPE RNA (ステップ 2.2) の準備を開始します。 フラグメント化とプライミングミックス ボリューム(μL) 無傷または部分的に分解された RNA (20 ng) 5 第1鎖合成反応バッファー 4 ランダムプライマー 1 総体積 10 表1:高品質RNAの断片化とプライミング反応高品質RNAの断片化およびプライミング反応の成分は、示されている量に応じて氷上で組み立てられ、混合されるべきである。第一鎖合成反応バッファーとランダムプライマーのマスターミックスを作り、RNAサンプルに加えることができる。 DV 200 で分解/FFPE RNA を20%と分解するには、ステップ 2.2.1 に従ってください。 断片化を必要としない高度に分解された(FFPE)RNAの場合、表2に記載されているようにプライミング反応を組み立てます。インタクト RNA の場合は、必ずステップ 2.1 に従ってください。 数回上下にピペットで混ぜ合わせます。その後、マイクロ遠心分離機でサンプルを短時間スピンダウンします。 サンプルをサーマルサイクラーに入れ、プログラム#2 (補足表 2)を使用します。 チューブを氷に移し、分解性の高い(FFPE)RNAの第1鎖cDNA合成に進みます(ステップ3.2)。 プライミング反応 ボリューム(μL) FFPE RNA (40 ng) 5 ランダムプライマー 1 総体積 6 表2:高分解RNAに対するランダムプライミング反応高度に分解されたRNAのためのプライミング反応の成分は、ヌクレアーゼフリーPCRチューブで氷上に組み立てる必要があります。 3. 第1鎖cDNA合成 RIN > 2 で高品質/インタクト RNA を使用する場合は、ステップ 3.1.1 に従ってください。 インタクトRNA(高品質)の場合、表3に従って、ヌクレアーゼフリーPCRチューブで氷上で第1の鎖合成反応を組み立てます。 氷の上で反応を維持し、数回上下にピペットで完全に混ぜます。サンプルを微小遠心分離機で簡単にスピンダウンし、直接第1鎖合成インキュベーションに進みます(ステップ4)。 第1のストランド合成 ボリューム(μL) フラグメント化およびプライミング RNA (ステップ 2.1.3) 10 第1鎖合成特異性試薬 8 ファーストストランド合成酵素ミックス 2 総体積 20 表3:高品質RNAに対する第1の鎖合成反応高品質RNAの断片化およびプライミング反応の成分は、与えられた量に応じて氷の上に組み立てられ、混合されるべきである。第1鎖合成特異性試薬と第1鎖合成酵素ミックスのマスターミックスを作り、断片化した、プライミングされたRNAサンプルに添加することができます。 DV 200 で分解/FFPE RNA を20%と分解するには、ステップ 3.2.1 に従ってください。 高分解RNA(FFPE)の場合、表4に従って、ヌクレアーゼフリーPCRチューブで氷上で第1の鎖合成反応を組み立てる。 氷の上で反応を維持し、数回上下にピペットで完全に混ぜます。サンプルを微小遠心分離機で簡単にスピンダウンし、直接第1鎖合成インキュベーションに進みます(ステップ4)。 第1のストランド合成 ボリューム(μL) プライミング RNA (ステップ 2.2.3) 6 第1鎖合成反応バッファー 4 第1鎖特異性試薬 8 ファーストストランド合成酵素ミックス 2 総体積 20 表4:高分解RNAに対する第1の鎖合成反応。高度に分解されたRNAの断片化およびプライミング反応の成分は、示された体積に応じて氷上に組み立てられ、混合されるべきである。第1鎖合成反応バッファー、第1鎖合成特異性試薬、第1鎖合成酵素ミックスのマスターミックスを作り、プライミングRNAサンプルに添加することができます。 4. 第一鎖合成インキュベーション チューブを氷の上に置いておき、数回上下にピペットで混ぜ合わせます。マイクロ遠心分離機でサンプルを簡単にスピンダウンします。プログラム#3(補足表2)に続いて、予熱熱サイクラーでサンプルをインキュベートします。 5. 第二鎖cDNA合成 第2の鎖cDNA合成反応を、表5に記載された成分を組み立てて、ステップ4.1から第1の鎖反応生成物を含めて調製する。 第二鎖合成反応 ボリューム(μL) 第1ストランド合成製品(ステップ4.1) 20 第二鎖合成反応バッファー 8 第二鎖合成酵素ミックス 4 ヌクレアーゼフリーの水 48 総体積 80 表5:第2鎖合成反応。第2鎖cDNA合成反応の成分は、図に示す体積に応じて、氷上で組み立てられ、混合されるべきである。第2鎖合成反応バッファー、第2鎖合成酵素ミックス、ヌクレアーゼフリー水のマスターミックスを作り、第1鎖合成産物に添加することができます。 チューブを氷の上に置いておき、数回上下にピペットで混ぜ合わせます。プログラム#4(補足表2)に続いてサーマルサイクラーでインキュベートします。 6. SPRI(固相可逆固定固定)ビーズを用いたcDNAクリーンアップ SPRIビーズを使用前に少なくとも30分間室温まで温め、約30sの渦SPRIビーズを再サスペンドします。 第2鎖合成反応に144μLの再懸濁ビーズを加える(約80μL)。少なくとも10回上下にピペットで混ぜ、室温で5分間インキュベートします。 マイクロ遠心分離機でチューブを短く回転させ、チューブを磁気ラックに置き、ビーズと上清を分離します。溶液が明確になってから、慎重に除去し、上清を廃棄します。DNAを含むビーズを邪魔しないように注意してください。 磁気ラックの上で、作製した80%エタノールをチューブに180μL加えます。室温で30sをインキュベートし、慎重に除去し、上清を廃棄します。 合計 2 つの洗浄手順に対して、手順 6.4 を 1 回繰り返します。 残留エタノールを完全に除去します。磁気ラックにチューブを残し、蓋を開けた状態で約3分間、または目に見えて乾燥するまでビーズを乾燥させます。これはDNAの回収量が低下する可能性があるため、ビーズを乾燥させないでください。 磁石からチューブを取り出し、ビーズに53 μL 0.1x TEバッファ(試薬キットに含まれるもの、補足表1を参照)を加えます。ピペットを少なくとも10回上下に混ぜ、十分に混ぜます。室温で2分間インキュベートします。 チューブを磁気ラックに置き、ビーズを上清から完全に分離できるようにします。清浄ヌクレアーゼフリーPCRチューブに上清の50 μLを移します。ビーズを邪魔しないように注意してください。これはプロトコル中の任意の停止点であり、cDNAサンプルは-20°Cで保存され得る。 7. cDNAライブラリの修復の終了 表6に記載されている成分をステップ6.8から第2の鎖合成産物に組み立てることにより、氷上での終期修復反応を組み立てます。 終了修復反応 ボリューム(μL) 第二鎖合成製品(ステップ6.8) 50 終了修復リアクション バッファ 7 エンドリペア酵素ミックス 3 総体積 60 表6:修復反応を終了する。エンド修復反応の成分は、示されているボリュームに応じて、組み立て、氷上に混合する必要があります。エンドリペア反応バッファーとエンドリペア酵素ミックスのマスターミックスを作り、第二鎖合成製品に添加することができます。 ピペットを50μLにセットし、ボリューム全体を少なくとも10回上下にピペットにして十分に混ぜます。チューブの側面からすべての液体を収集するために簡単に遠心分離します。よく混ぜることが大切です。少量の気泡の存在は、パフォーマンスを妨げない。 プログラム#5(補足表2)に続いて、サーマルサイクラーでサンプルをインキュベートします。 8. アダプターのライゲーション ライゲーション反応を設定する前に、表7に示すように、氷冷アダプター希釈バッファーでアダプターを希釈し、必要なサンプル数を掛け、さらに10%余分に加えた。希釈されたアダプターを氷の上に置いておく。 ライゲーション希釈 ボリューム(μL) アダプター 0.5 アダプター希釈バッファー 2 総体積 2.5 表 7: アダプター希釈.アダプタは、示されているボリュームに従って、アダプタ希釈バッファーを使用して氷上で希釈する必要があります。 表8に記載されている成分を、記載されている順序で、ステップ7.3から終末プレップ反応産物に添加して氷上でライゲーション反応を組み立てる。なお、ライゲーションマスターミックスとライゲーションエンハンサーは、事前に混合することができます。この混合物は、4°Cで少なくとも8時間安定である。アダプターのライゲーションステップで使用する前に、ライゲーションマスターミックス、ライゲーションエンハンサーおよびアダプターをプリミックスしないでください。 ライゲーション反応 ボリューム(μL) エンドプレップDNA(ステップ7.3) 60 希釈アダプター (ステップ 8.1) 2.5 ライゲーションエンハンサー 1 ライゲーションマスターミックス 30 総体積 93.5 表8:ライゲーション反応。アダプターライゲーション反応の成分は、示されている順序で示された体積に従って氷上で組み立てる必要があります。ライゲーションエンハンサーとライゲーションマスターミックスのマスターミックスを作り、希釈されたアダプターでエンドプレップDNAに追加することができます。希釈されたアダプターとライゲーションマスターミックスまたはライゲーションエンハンサーを混合してからエンドプレップDNAと混合しないでください。 ピペットを80μLにセットし、ボリューム全体を少なくとも10回上下にピペットにして十分に混ぜます。チューブの側面からすべての液体を収集するために迅速なスピンを実行します。ライゲーションマスターミックスは非常に粘性があります。不完全な混合はライゲーション効率の低下をもたらすので、ライゲーション反応の適切な混合を確保するように注意してください。少量の気泡の存在は、パフォーマンスを妨げない。 プログラム#6 (補足表 2)をインキュベートし、サーマルサイクラーからライゲーション混合物を取り出し、3 μL のアダプター処理酵素を加え、合計容量 96.5 μL を得ました。 ピペットを数回上下に何度か混合し、プログラム#7(補足表2)に従ってインキュベートしてから直ちにライゲーション反応の精製に進みます。 9. SPRIネズを用いたライゲーション反応の精製 SPRIビーズを使用前に少なくとも30分間室温まで温め、約30分間渦SPRIビーズを再サスペンドします。 87 μLの再懸濁SPRIビーズを加え、少なくとも10回上下にピペットで混ぜます。室温で10分間インキュベートします。 マイクロ遠心分離機でチューブを短く回転させ、チューブを磁気ラックに置き、ビーズと上清を分離します。溶液が明らかになった後(〜5分)、慎重に除去し、上清を廃棄します。ビーズを捨てないでください。 磁気ラックの上で、作製した80%エタノールをチューブに180μL加えます。室温で30sをインキュベートし、慎重に除去し、上清を廃棄します。合計 2 つの洗浄手順に対して、ステップ 9.4 を 1 回繰り返します。 残留エタノールを完全に除去します。磁気ラックにチューブを残し、蓋を開けた状態で約3分間、または目に見えて乾燥するまでビーズを乾燥させます。これはDNAの回収量が低下する可能性があるため、ビーズを乾燥させないでください。 磁石からチューブを取り出し、17 μLの0.1x TEバッファーをビーズに加えます。ピペットを少なくとも10回上下に混ぜ、十分に混ぜます。室温で2分間インキュベートし、チューブを磁気ラックに置き、ビーズを上清から完全に分離させます。 上清の 15 μL をクリーンヌクレアーゼフリー PCR チューブに移します。ビーズを邪魔しないように注意してください。これはプロトコル中の任意の停止点であり、アダプター-リゲーテッドDNAは-20°Cで保存され得る。 10. アダプターのリゲーテッド DNA の PCR 濃縮 表 9に記載されている PCR 反応をセットアップします。プリキャプチャPCRマスターミックスとユニバーサルプライマーを含むマスターミックスを作り、アダプター合わせDNAに加えることができます。多重化シーケンスの場合は、各反応に固有のインデックスプライマーを使用し、各サンプルに個別に追加します。 PCR エンリッチメント ボリューム(μL) アダプター合わせDNA (ステップ 10.1) 15 プリキャプチャPCRマスターミックス 25 ユニバーサル PCR プライマー 5 インデックス (X) プライマー 5 総体積 50 表9:アダプター合わせDNAのPCR濃縮。アダプターのリゲーテッド DNA 反応の PCR 濃縮のコンポーネントは、図に示されているボリュームに従って、組み立てて氷上に混合する必要があります。プリキャプチャPCRマスターミックスとユニバーサルPCRプライマーのマスターミックスを作り、アダプター合わせDNAに加えることができます。多重化シーケンスの場合、各サンプルには一意のインデックス プライマーを指定する必要があります。 10回軽くピペットで混ぜます。マイクロ遠心分離機でチューブを短く回転させ、サーマルサイクラーに入れ、プログラム#8(補足表2)を使用してPCR増幅を行います。 11. SPRIビーズを用いたPCR反応の精製 SPRIビーズを使用前に少なくとも30分間室温まで温め、約30分間渦SPRIビーズを再サスペンドします。 各PCR反応に45μLの再懸濁ビーズを加えます(約50μL)。室温で5分間インキュベートする前に、少なくとも10回上下にピペットでよく混ぜます。 マイクロ遠心分離機でチューブを短く回転させ、チューブを磁気ラックに置き、ビーズと上清を分離します。溶液が明らかになった後(〜5分)、慎重に除去し、上清を廃棄します。DNAを含むビーズを邪魔しないように注意してください。 磁気ラックの中で、作製した80%エタノールを180μLのチューブに加えます。室温で30sをインキュベートし、慎重に除去し、上清を廃棄します。合計 2 つの洗浄手順に対して、ステップ 11.4 を 1 回繰り返します。 残留エタノールを完全に除去します。磁気ラックにチューブを残し、蓋を開けた状態で約3分間、または目に見えて乾燥するまでビーズを乾燥させます。これはDNAの回収量が低下する可能性があるため、ビーズを乾燥させないでください。 磁石からチューブを取り出し、ビーズに23 μL 0.1x TEバッファーを追加します。ピペットを少なくとも10回上下に混ぜ、十分に混ぜます。室温で2分間インキュベートします。 チューブを磁気ラックに置き、ビーズを上清から完全に分離できるようにします。上清子の20 μLをクリーンヌクレアーゼフリーPCRチューブに移します。ビーズを邪魔しないように注意してください。これはプロトコルの任意の停止点であり、プリキャプチャーライブラリは-20°Cに格納されてもよい。 12. プリキャプチャーライブラリの検証と定量化 フルオロメーターと高感度アッセイキットを使用して、プリキャプチャーライブラリの濃度を測定します。第2部:ハイブリダイゼーションとキャプチャに進むには、最低歩留まり200ngが必要です。 デジタル電気泳動システムで1μLのライブラリを実行します。必要に応じて、高感度チップの過負荷を避けるためにサンプルを希釈します。 エレクトロフェログラムが、ピークサイズが約 250~400 bp の狭い分布を示していることを確認します(代表的な結果、図3および図4を参照)。 128 bp のピーク(アダプターダイマー)がバイオアナライザのトレースに表示され、信号の強度が 250-400 bp ライブラリ信号の強度 ≥(代表的な結果を参照)の場合(例えば、図5を参照)、サンプル容量(ステップ 11.7 から 50 μL)を 0.1x TE バッファーで起動し、SPRI Bead 浄化処理を繰り返します(ステップ 11)。これはプロトコルの任意の停止点であり、プリキャプチャーライブラリは、パートIIに移る前に-20°Cで保存され得る:ImmunoPrismハイブリダイゼーションおよびキャプチャー。 第二部:ハイブリダイゼーションとキャプチャー 13. ブロッキングオリゴ、Cot-1 DNA、プリキャプチャーライブラリーDNA、ドライを組み合わせる ステップ11で作成したバーコードライブラリとステップ12で定量化し、ヌクレアーゼフリーPCRチューブまたは1.5mLマイクロチューブにCot-1 DNAとブロッキングオリゴを混ぜ合わせる。. 試薬 数量/数量 ステップ 10.10 のバーコードライブラリ 200 ng コット1 DNA 2 μg ブロッキングオリゴ 2 μL 表10:ハイブリダイゼーション調製および乾燥ハイブリダイゼーションの準備でライブラリを乾燥させるために組み合わせる成分は、示されている量に応じて組み立てる必要があります。 30~45°Cに設定した真空濃縮器を使用してチューブの内容物を乾燥させます。これは、プロトコル内のオプションの停止点です。乾燥後、チューブは、室温(15〜25°C)で一晩または-20°Cで長く保管され得る。 14. DNA捕捉プローブをライブラリとハイブリダイズする 2xビーズ洗浄バッファーおよびハイブリダイゼーションバッファー、ハイブリダイゼーションバッファーエンハンサー、イムノプリズムプローブパネル、10xウォッシュバッファー1、10xウォッシュバッファ2、10xウォッシュバッファ3、および10xストリンジェントウォッシュバッファを室温で解凍します。使用前に、塩の結晶化のためのハイブリダイゼーションバッファーを検査します。結晶が存在する場合は、65°Cでチューブを加熱し、緩衝液が完全に可溶化されるまで断続的に振る。 室温で、チューブ内にハイブリダイゼーションマスターミックスを作成します。サンプル数でボリュームを乗算し、表 11に続いて 10% 余分に追加します。 ハイブリダイゼーションマスターミックス ボリューム(μL) ハイブリダイゼーションバッファ 8.5 ハイブリダイゼーションバッファエンハンサー 2.7 イムノプリズムプローブパネル 5 ヌクレアーゼフリー水 0.8 総体積 17 表 11: ハイブリダイゼーションマスターミックスハイブリダイゼーションマスターミックスのコンポーネントは、図に示されているボリュームに応じて、室温で組み立てられ、混合する必要があります。 ボルテックスまたはピペットを上下に混ぜ合わせます。次いで、乾燥DNAを含む各チューブにハイブリダイゼーションマスターミックスの17μLを加える。チューブを密封し、室温で5分間インキュベートします。 サンプルをボルテックスし、完全に混合されていることを確認し、マイクロ遠心分離機でサンプルを短時間スピンダウンします。該当する場合は、各サンプルを1.5 mLマイクロチューブからヌクレアーゼフリーPCRチューブに移します。 サンプルをサーマルサイクラーに入れ、プログラム#9を実行します (補足表 2)。 インキュベーション中に、洗浄バッファー(ステップ15)およびストレプトアビジンビーズ(ステップ16)を準備し、緩衝液を予熱し、ストレプトアビジンビーズを平衡化するのに十分な時間を確保する。 15. 洗浄バッファーの準備 注:洗浄バッファーは、2x (ビーズウォッシュバッファー) または 10x (他のすべての洗浄バッファー) 濃縮溶液として供給されます。 ハイブリダイゼーションインキュベーションの間に、2xビーズウォッシュバッファと10xウォッシュバッファを希釈して1xの作業溶液を作成し、必要なサンプル数を掛け、10%余分なサンプルを追加します。10xウォッシュバッファー1が曇っている場合は、65°Cの水浴または加熱ブロックでボトルを加熱し、微粒子を再懸濁させる。凍結した1xウォッシュバッファーは、解凍後に混合する必要があります。 洗浄バッファー 濃縮バッファー (μL) ヌクレアーゼフリー水(μL) 合計(μL) ビーズウォッシュバッファー 150 150 300 洗浄バッファー 1 25 225 250 洗浄バッファー 2 15 135 150 洗浄バッファー 3 15 135 150 ストリンジェントウォッシュバッファー 30 270 300 表12:洗浄バッファー希釈。濃度洗浄バッファーは、示されている体積に従って、室温でヌクレアーゼを含まない水で希釈する必要があります。 1xウォッシュバッファーをヌクレアーゼフリーPCRチューブにアリコートし、表13に示すように適切な温度に配置する。ピペッティングに十分な過大を含むようにしてください。加熱バッファの場合は、蓋を70°Cに設定して65°Cに設定したサーマルサイクラーを使用します。 洗浄バッファー 保持温度 ボリューム/チューブ(μL) チューブ/サンプルの数 ビーズウォッシュバッファー RT (15-25 °C) 100 3 洗浄バッファー 1 65°C 100 1 洗浄バッファー 1 RT (15-25 °C) 150 1 洗浄バッファー 2 RT (15-25 °C) 150 1 洗浄バッファー 3 RT (15-25 °C) 150 1 ストリンジェントウォッシュバッファー 65°C 150 2 表 13: 希釈洗浄バッファー.希釈された洗浄バッファーは、示されているサンプルあたりの体積およびチューブ数に応じて、別々のチューブに分ける必要があります。洗浄バッファーは、使用前に指定温度で保持する必要があります。 表14に示すように、ビーズ再懸濁ミックスを室温で準備し、必要なサンプル数を掛け、10%余分に加えます。 ビーズリサスペンションミックス ボリューム(μL) ハイブリダイゼーションバッファ 8.5 ハイブリダイゼーションバッファエンハンサー 2.7 ヌクレアーゼフリー水 5.8 総体積 17 表14:ビーズリサスペンションミックス。ビーズ再懸濁ミックスのコンポーネントは、図に示されているボリュームに応じて、室温で組み立てられ、混合する必要があります。 16. ストレプトアビジンビーズを準備する 使用前に少なくとも30分間室温でストレプトアビジンビーズを平衡化します。15 s、アリコート 50 μL のビーズを捕捉毎ヌクレアーゼフリー PCR チューブにボルテックスして、ビーズを完全に混合します。 1xビーズウォッシュバッファ(ステップ15.1で作成)の100 μLを各チューブに加えます。ピペットを10回軽く上下に混ぜます。チューブを磁気ラックに置き、ビーズを上清から完全に分離できるようにします。 透明な上清を取り除き、廃棄します。ビーズを邪魔しないように注意してください。 以下の洗浄を行う。 磁気ラックから取り外します。ビーズを含む各チューブに100μLのビーズウォッシュバッファを加え、ピペットを上下に10回加え、混ぜ合わせます。 チューブを磁気ラックに置き、ビーズを上清から完全に分離できるようにします。 透明な上清を慎重に取り外して捨てます。 合計 2 回の処理について、手順 16.4 を 1 回繰り返します。 磁気ラックから取り外します。ステップ15.3から17 μLのビーズリサスペンションミックスを各チューブに加えます。ピペットを何度か上下に繰り上げて、徹底的に混ぜます。ビーズがチューブの側面に貼り付けられていないことを確認します。必要に応じて、チューブを短く回転して下部のビーズを集めます。 17. ハイブリッド化ターゲットをストレプトアビジンビーズにバインドする 4時間のハイブリダイゼーションインキュベーションが完了したら、サーマルサイクラーからサンプルを取り出し、加熱した蓋を70°Cにセットして65°Cでインキュベートするようにサーマルサイクラーをセットします。 マルチチャンネルピペットを使用して、完全に均質化されたビーズの17 μLをサンプルに移します。10回上下にピペットで十分に混ぜます。 プログラム#10(補足表2)の後に熱サイクラーにチューブを入れることで、DNAをビーズに結合する。インキュベーション中に、ストリップチューブを10〜12分ごとに短く取り外し、3sの渦を少し外してビーズが懸濁液中に残るようにします。または、数回上下にピペットで混ぜます。ストレプトアビジンビーズを洗い流す(ステップ18)。 18. ストレプトアビジンビーズを洗浄してバインドされていないDNAを除去する ステップ15.2の1xウォッシュバッファを使用し、洗浄中に熱いバッファをサーマルサイクラーに保存します。 ステップ 17.3 からチューブに 100 μL の予熱 1x ウォッシュバッファー 1 を加えます。10回上下にピペットで十分に混ぜます。チューブを磁気ラックに置き、ビーズを上清から完全に分離できるようにします。 ピペットと非結合DNAを含む上清を廃棄します。磁気ラックから取り外します。 以下の65°C洗浄を行う。 150 μLの予熱1xストリンジェントウォッシュバッファーを追加します。 少なくとも10回上下にピペットで混ぜます。ピペッティング中に泡を避けてください。すべてのチューブにビーズが完全に再懸濁されていることを確認してください。 65°Cで5分間サーマルサイクラーにインキュベートします。 チューブを磁気ラックに置き、ビーズを上清から完全に分離できるようにします。ピペットと非結合DNAを含む上清を廃棄します。磁気ラックから取り外します。 2 つのストリンジェントなワッシュの合計について、ステップ 18.4 を繰り返します。 最初の室温洗浄を行います。 室温1xウォッシュバッファー1の150μLを加えます。 ピペットを10~20回上下にしてビーズを完全に再サスペンずします。 チューブを密封し、2分間インキュベートし、30秒間穏やかに渦を起き、30秒間休みます。すべての井戸のビーズは、インキュベーション全体を通してすべてのチューブに完全に再懸濁されたままであることを確認してください。 チューブを簡単に遠心分離します。 チューブを磁気ラックに置き、ビーズを上清から完全に分離できるようにします。ピペットと上清を捨てます。 チューブを密封し、一時的に遠心分離機を押します。磁気ラックに戻し、10 μl ピペットを使用して、残留洗浄バッファーを取り除きます。 2回目の室温洗浄を行います。 室温1xウォッシュバッファ2の150 μLを加えます。 ピペットを10~20回上下にしてビーズを完全に再サスペンずします。 チューブを密封し、2分間インキュベートし、30秒間穏やかに渦を起き、30秒間休みます。すべての井戸のビーズは、インキュベーション全体を通してすべてのチューブに完全に再懸濁されたままであることを確認してください。 チューブを簡単に遠心分離します。 洗浄バッファー 2 に再懸濁したビーズの全容積を、ヌクレアーゼフリー PCR チューブに移します。重要:ビーズを新鮮なチューブに移すことによって、ターゲット外の汚染を避ける必要があります。 チューブを磁気ラックに置き、ビーズを上清から完全に分離できるようにします。ピペットと上清を捨てます。 チューブを密封し、一時的に遠心分離機を押します。磁気ラックに戻し、10 μl ピペットを使用して、残留洗浄バッファーを取り除きます。 第3の室温洗浄を行う。 室温1xウォッシュバッファー3の150μLを加えます。 ピペットを10~20回上下にしてビーズを完全に再サスペンずします。 チューブを密封し、2分間インキュベートし、30秒間穏やかに渦を起き、30秒間休みます。すべての井戸のビーズは、インキュベーション全体を通してすべてのチューブに完全に再懸濁されたままであることを確認してください。 チューブを簡単に遠心分離します。 チューブを磁気ラックに置き、ビーズを上清から完全に分離できるようにします。ピペットと上清を捨てます。 チューブを密封し、一時的に遠心分離機を押します。磁気ラックに戻り、10 μL ピペットを使用して、残留洗浄バッファーを取り除きます。 磁気ラックから取り出し、20 μLのヌクレアーゼを含まない水をビーズに加えます。 ピペットを10回上下にして、チューブの側面に貼り付けたビーズが再懸濁されていることを確認します。 重要: ビーズを捨てないでください。ステップ19で捕捉されたDNAを持つ再懸濁ビーズの20 μL全体を使用してください。 19. 最終、ポストキャプチャPCRエンリッチメントを実行 表 15に従って、ポストキャプチャ PCR マスター ミックスを次の表に従って準備し、必要なサンプル数を乗算し、10% 余分に追加します。 ポストキャプチャPCRマスターミックスコンポーネント ボリューム(μL) ポストキャプチャPCRマスターミックス 25 ポストキャプチャPCRプライマーミックス 1.25 ヌクレアーゼフリー水 3.75 総体積 30 表 15: ポストキャプチャ PCR マスター ミックスポストキャプチャPCRマスターミックスのコンポーネントは、図に示されている量に応じて、氷上で組み立てられ、混合する必要があります。 各サンプルにポストキャプチャPCRマスターミックスの30 μLを加え、最終反応量50μLを得るために、10回のピペットで完全に混合します。 PCR チューブをサーマルサイクラーに入れ、プログラム #11 (補足表 2)に従ってインキュベートします。 20. ポストキャプチャPCRフラグメントを精製する SPRIビーズを使用前に少なくとも30分間室温まで温め、約30分間渦SPRIビーズを再サスペンドします。 各PCR濃縮キャプチャに75 μLの再懸濁ビーズを加えます(50 μL)。少なくとも10回上下にピペットで混ぜます。ストレプトアビジンビーズは、SPRIビーズ精製を妨げません。室温で5分間インキュベートします。 マイクロ遠心分離機でチューブを短く回転させ、チューブを磁気ラックに置き、ビーズと上清を分離します。溶液が明確になってから、慎重に除去し、上清を廃棄します。DNAを含むビーズを邪魔しないように注意してください。 磁気ラックの中で、作製した80%エタノールを180μLのチューブに加えます。室温で30sをインキュベートし、慎重に除去し、上清を廃棄します。 合計 2 つの洗浄手順に対して、ステップ 20.4 を 1 回繰り返します。 残留エタノールを完全に除去します。チューブを磁気ラックに置いたまま、蓋を開けた状態で3分、または目に見えて乾燥するまで空気を乾かします。ビーズを過度に乾燥させないでください。これは、DNAの回復が低下する可能性があります。 磁石からチューブを取り外します。22 μLの0.1x TEバッファーを加えてビーズからDNAを溶出します。数回上下にピペットでうまく混ぜます。室温で2分間インキュベートします。溶液がはっきりするまで、磁気ラックの上にチューブを置きます。 上清の20μLを取り除き、きれいなヌクレアーゼフリーPCRチューブに移し、ビーズを邪魔しないように注意してください。これはプロトコル内の任意の停止点であり、ライブラリは-20°Cで保存されてもよい。 21. ライブラリの検証と定量化 フルオロメーターと高感度アッセイキットを使用して、キャプチャされたライブラリの濃度を測定します。 デジタル電気泳動高感度DNAチップを用いて、キャプチャしたライブラリの平均フラグメント長を測定し、システムソフトウェアを使用して各ライブラリの平均フラグメントサイズを計算します。平均フラグメントサイズは約 250~400 bp である必要があります(代表的な結果、図6および図7を参照)。これはプロトコル内の任意の停止点であり、完成したライブラリは-20°Cで保存されてもよい。 22. シーケンスプラットフォームでのシーケンス シーケンシングの場合は、ライブラリを2nMに希釈し、シーケンサーのロードと操作に関するメーカーのガイドラインに従ってください。長さが 50 bp 以上の最小深さ 1,500 万のシングルエンド読み取りまで、シーケンス ライブラリ。 23. 免疫プロファイルを生成し、クラウドベースのインフォマティクスツールであるプリズムポータルでバイオマーカーを発見するためのシーケンシングデータの分析 https://prism.cofactorgenomics.com/にアクセスしてプリズム アカウントを作成する ログインしたら、プリズムの任意のページから上部ツールバーの[新しいプロジェクトを送信]をクリックして、非多重化されたFASTQシーケンスファイルをアップロードするか、またはPrismアカウントでBaseSpaceに保存されたファイルをアップロードします。 プロジェクト名を含む新しいプロジェクト フォームに入力し、グループまたはコホート別のサンプルを入力します。サンプルのグループ化と対応するグループ名は、バイオマーカー発見レポートを生成するために必要です。バイオマーカー検出レポートを生成するには、グループごとに最低 3 つのサンプルが必要です。[アプリケーションの起動] ボタンをクリックしてフォームを送信します。成功した場合は確認ページが表示されます。 ログイン中に、上部のツールバーまたは Prism の任意のページで [結果を表示] をクリックします。Prism を使用すると、ユーザーは、提出されたプロジェクトの状態を確認し、プロジェクトごとにサンプルレポートとバイオマーカー レポートを表示できます。ユーザーが Prism で作成したプロジェクトのテーブルが表示されます。テーブルには、ステータス、名前、および提出日の 3 つの列があります。注: 各プロジェクトのステータスは、次のとおりです。• プロジェクト分析が現在実行されている「実行中」、または• プロジェクト分析が完了し、レポートが利用可能な「成功」。 プロジェクトが解析を完了した場合(「成功」ステータスで示される)、個別サンプルレポートとバイオマーカー検出レポートを表示します。バイオマーカー検出レポートは、プロジェクトにグループごとに必要なサンプルが最低 3 つ含まれている場合にのみ使用できます。 これらのレポートにアクセスするには、プロジェクトのテーブルに戻り、プロジェクトの名前をクリックします。このプロジェクト ページには、プロジェクトのサンプルごとに行が含まれるテーブルがあります。各サンプルの個別レポートにアクセスするには、[レポート] 列の各行のリンクをクリックします。表のすぐ下にあるバイオマーカー検出レポートのリンクをクリックします。このページにリンクがない場合、プロジェクトは解析を完了していません。