Voorspellende immuunmodellering van vaste tumoren

De menselijke weefselmonsters die in de hier getoonde representatieve resultaten worden gebruikt, zijn gekocht bij een gerenommeerde entiteit (TriStar Technology Group) en hebben de toestemming van de donor meegedeeld die academisch en commercieel onderzoek mogelijk maakt, evenals goedkeuring van een bevoegde ethische Commissie. Deel I: Voorbereiding van de bibliotheek vooraf vastleggen 1. RNA Kwantificering en kwalificatie Kwantificeer RNA met behulp van een fluormetrische test om de juiste input voor de test te bepalen. Beoordeel de kwaliteit van het input RNA met behulp van elektroforese om het RNA Integrity Number (RIN) en het percentage fragmenten >200 nucleotiden (DV200)waarden te bepalen. Voor intacte (RIN > 7) of gedeeltelijk gedegradeerde RNA-monsters (RIN = 2 tot 7) volgt u de bibliotheekvoorbereidingsstappen voor hoogwaardig/intact RNA, te beginnen met stap 2.1. De kwaliteit van het RNA is belangrijk voor het selecteren van de juiste fragmentatietijd in Thermal Cycler Program #1 (Aanvullende tabel 2). Voor sterk gedegradeerde monsters (bijvoorbeeld RIN = 1 tot 2 of FFPE) bepaal je de DV200-waarde. Deze monsters vereisen geen fragmentatie en volgen de instructies voor gedegradeerd RNA, te beginnen met stap 2.2. Bereid de juiste hoeveelheid totaal RNA voor elk monster voor door 20 ng RNA (High-Quality/Intact RNA met RIN > 2) of 40 ng RNA (Gedegradeerd/FFPE RNA met DV200 > 20%) te verdunnen tot 5 μL in nuclease-vrij water. Het verwerken van samples met DV200 < 20% wordt niet aanbevolen. Voor de controle-RNA-monsters die bij de kit zijn geleverd, moet u 1 μL van het juiste RNA verdunnen in 4 μL nuclease-vrij water. Controlemonsters volgen dezelfde verwerking als beschreven voor RNA-materialen van hoge kwaliteit (intact) of Gedegradeerd (FFPE), zoals gelabeld. Zie Aanvullende tabel 1 voor alle reagentia die in de kit zijn opgenomen. 2. RNA Fragmentatie en Priming Volg stap 2.1.1 voor RNA van hoge kwaliteit/intact met RIN > 2. Voor rna van hoge kwaliteit, monteer de fragmentatie en priming reactie op ijs in een nuclease-vrije PCR buis volgens tabel 1. Meng grondig door pipetteren op en neer meerdere malen. Draai vervolgens kort de monsters in een microcentrifugeOPMERKING: Voor alle centrifugespins in het protocol wordt een snelheid van ≥ 1.000 x g voor ten minste 3 s aanbevolen. Plaats de monsters in een thermische cycler en gebruik Programma #1 (Aanvullende tabel 2). Breng de buizen onmiddellijk over naar ijs en ga over naar First Strand cDNA Synthesis for High Quality RNA (Stap 3.1). Voor de gelijktijdige voorbereiding van zowel Hoge Kwaliteit als FFPE RNA, begin de voorbereiding van het FFPE RNA (Stap 2.2) tijdens de Fragmentatie Incubatie. Fragmentatie en Priming Mix Volume (μL) Intact of gedeeltelijk gedegradeerd RNA (20 ng) 5 Eerste bundel synthese reactiebuffer 4 Willekeurige primers 1 Totaal volume 10 Tabel 1: Fragmentatie en priming reactie voor hoogwaardig RNA. Componenten van de fragmentatie en priming reactie voor hoogwaardige RNA moeten worden geassembleerd en gemengd op ijs volgens de getoonde volumes. Een master mix van First Strand Synthesis Reaction Buffer en Random Primers kan worden gemaakt en toegevoegd aan de RNA monsters. Volg stap 2.2.1 voor Gedegradeerd/FFPE RNA met DV200 > 20%. Voor sterk gedegradeerd (FFPE) RNA dat geen fragmentatie vereist, monteer de priming reactie zoals beschreven in tabel 2. Voor intact RNA, vergeet niet om stap 2.1 te volgen. Meng grondig door pipetteren op en neer meerdere malen. Draai vervolgens kort de monsters in een microcentrifuge. Plaats de monsters in een thermische cycler en gebruik Programma #2 (Aanvullende tabel 2). Breng de buizen over naar ijs en ga over naar First Strand cDNA Synthesis for Highly Degraded (FFPE) RNA (Stap 3.2). Priming Reactie Volume (μL) FFPE RNA (40 ng) 5 Willekeurige primers 1 Totaal volume 6 Tabel 2: Willekeurige priming reactie voor sterk gedegradeerd RNA. Componenten van de primingreactie voor sterk gedegradeerd RNA moeten op ijs worden gemonteerd in een nuclease-vrije PCR-buis. 3. Eerste streng cDNA Synthese Volg stap 3.1.1 voor RNA van hoge kwaliteit/intact met RIN > 2. Voor intact RNA (hoge kwaliteit), monteer de Eerste Reactie van de Synthese van de Bundel op ijs in een nuclease-vrije buis PCR volgens Lijst 3. Het houden van de reacties op ijs, grondig mengen door pipetteren op en neer meerdere malen. Draai de monsters kort in een microcentrifuge en ga direct verder naar Eerste strengsynthese incubatie (Stap 4). Eerste strengsynthese Volume (μL) Gefragmenteerd en geprimed RNA (Stap 2.1.3) 10 Eerste strand synthese specificiteit Reagens 8 Eerste streng synthese enzymmix 2 Totaal volume 20 Tabel 3: Eerste reactie van de synthese van strengen voor RNA van hoge kwaliteit. Componenten van de fragmentatie en priming reactie voor hoge kwaliteit RNA moeten worden geassembleerd en gemengd op ijs volgens de gegeven volumes. Een master mix van First Strand Synthesis Specificiteit Reagent en First Strand Synthesis Enzyme Mix kan worden gemaakt en toegevoegd aan de gefragmenteerde en geprimed RNA monsters. Volg stap 3.2.1 voor Gedegradeerd/FFPE RNA met DV200 > 20%. Voor sterk gedegradeerd RNA (FFPE), monteren van de eerste strand synthese reactie op ijs in een nuclease-vrije PCR buis volgens tabel 4. Het houden van de reacties op ijs, grondig mengen door pipetteren op en neer meerdere malen. Draai de monsters kort in een microcentrifuge en ga direct verder naar Eerste strengsynthese incubatie (Stap 4). Eerste strengsynthese Volume (μL) Geprimed RNA (Stap 2.2.3) 6 Eerste bundel synthese reactiebuffer 4 Eerste strand specificiteit reagent 8 Eerste streng synthese enzymmix 2 Totaal volume 20 Tabel 4: Eerste reactie van de synthese van strengen voor sterk gedegradeerd RNA. Componenten van de fragmentatie en priming reactie voor sterk gedegradeerd RNA moeten worden geassembleerd en gemengd op ijs volgens de getoonde volumes. Een master mix van First Strand Synthesis Reaction Buffer, First Strand Synthesis Specificity Reagent, en First Strand Synthesis Enzyme Mix kan worden gemaakt en toegevoegd aan de geprimed RNA monsters. 4. Eerste strandsynthese incubatie Houd de buizen op ijs, meng grondig door pipetteren op en neer meerdere malen. Draai de monsters kort in een microcentrifuge. Bebroed de monsters in een voorverwarmde thermische cycler volgende Programma #3 (Aanvullende tabel 2). 5. Tweede onderdeel cDNA Synthese Bereid de tweede streng cDNA synthesereactie op ijs door de in tabel 5genoemde componenten samen te stellen, inclusief het eerste onderdeelreactieproduct uit stap 4.1. Tweede onderdeel synthese reactie Volume (μL) Eerste strandsyntheseproduct (stap 4.1) 20 Tweede onderdeel synthese reactiebuffer 8 Tweede streng synthese enzymmix 4 Nuclease-vrij water 48 Totaal volume 80 Tabel 5: Tweede onderdeel Synthese reactie. Componenten van de tweede streng cDNA synthese reactie moeten worden geassembleerd en gemengd op ijs volgens de getoonde volumes. Een master mix van de Second Strand Synthesis Reaction Buffer, Second Strand Synthesis Enzyme Mix en Nuclease-vrij water kunnen worden gemaakt en toegevoegd aan het Eerste Onderdeel Synthese Product. Houd de buizen op ijs, meng grondig door pipetteren op en neer meerdere malen. Incubeer in een thermische cycler volgende Programma #4 (Aanvullende tabel 2). 6. cDNA Cleanup Met behulp van SPRI (Solid Phase Reversible Immobilisatie) Kralen Laat de SPRI Beads minstens 30 minuten voor gebruik op kamertemperatuur worden en draai vervolgens de SPRI Beads ongeveer 30 s om opnieuw op te schorten. Voeg 144 μL opnieuw gesuspendeerde kralen toe aan de tweede strengsynthesereactie (~80 μL). Meng goed door ppetteren op en neer ten minste 10 keer en incubate voor 5 min bij kamertemperatuur. Draai de buizen kort in een microcentrifuge en plaats de buizen op een magnetisch rek om kralen van het supernatant te scheiden. Nadat de oplossing duidelijk is, zorgvuldig verwijderen en gooi de supernatant. Wees voorzichtig niet te storen de kralen, die DNA bevatten. Voeg 180 μL vers bereide 80% ethanol toe aan de buizen terwijl u op het magnetische rek zit. Incubeer bij kamertemperatuur voor 30 s, en verwijder en gooi vervolgens voorzichtig de supernatant weg. Herhaal stap 6.4 eenmaal voor een totaal van 2 waspassen. Verwijder de resterende ethanol volledig. Laat de buizen op het magnetisch rek en de lucht drogen de kralen voor ongeveer 3 minuten met het deksel open, of tot zichtbaar droog. Droog de kralen niet te drogen, omdat dit kan leiden tot een lager herstel van DNA. Haal de buizen van de magneet en voeg 53 μL 0,1x TE Buffer (inbegrepen in reagent kit, zie Aanvullende Tabel 1) aan de kralen. Pipetteer minstens 10 keer op en neer om goed te mengen. Incubeer gedurende 2 min bij kamertemperatuur. Plaats de buizen op een magnetisch rek, waardoor kralen volledig gescheiden van de supernatant. Breng 50 μL van de supernatant over naar het reinigen van nuclease-vrije PCR-buizen. Let erop dat u de kralen niet verstoort. Dit is een optionele stopplaats in het protocol, cDNA-monsters kunnen worden opgeslagen bij -20 °C. 7. Einde reparatie van cDNA-bibliotheek Monteer de eindreparatiereactie op ijs door de in tabel 6 vermelde componenten in te stellen op het tweede onderdeelsyntheseproduct uit stap 6.8. Reactie van eindreparatie Volume (μL) Tweede onderdeelsyntheseproduct (stap 6.8) 50 Reactiebuffer voor reparatie beëindigen 7 Einde Reparatie Enzym Mix 3 Totaal volume 60 Tabel 6: Reactie reparatie beëindigen. Onderdelen van de eindreparatiereactie moeten op ijs worden gemonteerd en gemengd op basis van de getoonde volumes. Een master mix van de End Repair Reaction Buffer en de End Repair Enzyme Mix kan worden gemaakt en toegevoegd aan de Tweede Streng Synthese Product. Stel een pipet in op 50 μL en pipet het hele volume minstens 10 keer op en neer om grondig te mengen. Kort centrifugeom alle vloeistof van de zijkanten van de buizen te verzamelen. Het is belangrijk om goed te mengen. De aanwezigheid van een kleine hoeveelheid bellen zal de prestaties niet verstoren. Bebroed de monsters in een thermische cycler volgende Programma #5 (Aanvullende tabel 2). 8. Adapterligatie Verdun de adapter vóór het instellen van de ligatiereactie in de ijskoude adapterverdunningsbuffer zoals aangegeven in tabel 7,vermenigvuldigen d.m.v. het vereiste aantal monsters, plus 10% extra. Houd de verdunde adapter op ijs. Ligatie Verdunning Volume (μL) Adapter 0.5 Verdunningsbuffer voor adapters 2 Totaal volume 2.5 Tabel 7: Verdunning van de adapter. De adapter moet op ijs worden verdund met een verdunningsbuffer voor adapters op basis van de getoonde volumes. Monteer de ligatiereactie op ijs door de componenten zoals beschreven in tabel 8, in de vermelde volgorde, toe te voegen aan het eindprep-reactieproduct uit stap 7.3. Merk op dat de Ligation Master Mix en Ligatie Enhancer kan worden gemengd van tevoren. Dit mengsel is stabiel gedurende ten minste 8 uur bij 4 °C. Meng de Ligation Master Mix, Ligation Enhancer en Adaptor niet voor gebruik in de Adaptor Ligation Step. Ligatie Reactie Volume (μL) Einde prepped DNA (Stap 7.3) 60 Verdunde adapter (stap 8.1) 2.5 Ligatie Enhancer 1 Ligatie Master Mix 30 Totaal volume 93.5 Tabel 8: Ligatiereactie. Componenten van de adaptorligatiereactie moeten op ijs worden gemonteerd op basis van de in de aangegeven volgorde getoonde hoeveelheden. Een master mix van Ligation Enhancer en Ligation Master Mix kan worden gemaakt en toegevoegd aan het End Prepped DNA met Diluted Adaptor. Meng de verdunde adapter en de Ligation Master Mix of Ligatie Enhancer niet voordat u het met het End Prepped DNA mengt. Stel een pipet in op 80 μL en pipet het hele volume minstens 10 keer op en neer om grondig te mengen. Voer een snelle draai uit om alle vloeistof van de zijkanten van de buizen te verzamelen. De Ligation Master Mix is erg stroperig. Zorg ervoor dat de ligatiereactie voldoende wordt gemengd, aangezien onvolledige vermenging zal leiden tot een verminderde ligatie-efficiëntie. De aanwezigheid van een kleine hoeveelheid bellen zal de prestaties niet verstoren. Incubeer volgende programma #6 (Aanvullende tabel 2), en verwijder vervolgens het ligatiemengsel uit de thermische cyclusr en voeg 3 μL Adaptor Processing Enzyme toe, wat resulteert in een totaal volume van 96,5 μL. Pipetteer meerdere malen op en neer om goed te mengen, en vervolgens uitbroeden na Programma #7 (Aanvullende tabel 2) alvorens onmiddellijk over te gaan tot zuivering van ligatie reactie. 9. Zuivering van ligatiereactie Met Behulp van SPRI Neads Laat SPRI Beads minstens 30 minuten voor gebruik op kamertemperatuur worden en draai vervolgens spri-kralen voor ongeveer 30 s om opnieuw op te schorten. Voeg 87 μL opnieuw gesuspendeerde SPRI-kralen toe en meng goed door minstens 10 keer op en neer te stampen. Incubeer 10 min bij kamertemperatuur. Draai de buizen kort in een microcentrifuge en plaats de buizen op een magnetisch rek om kralen van het supernatant te scheiden. Nadat de oplossing duidelijk is (~ 5 min), verwijder en gooi de supernatant zorgvuldig weg. Gooi de kralen niet weg. Voeg 180 μL vers bereide 80% ethanol toe aan de buizen terwijl u op het magnetische rek zit. Incubeer bij kamertemperatuur voor 30 s, en verwijder en gooi vervolgens voorzichtig de supernatant weg. Herhaal stap 9.4 eenmaal voor een totaal van 2 waspassen. Verwijder de resterende ethanol volledig. Laat de buizen op het magnetisch rek en de lucht drogen de kralen voor ongeveer 3 minuten met het deksel open, of tot zichtbaar droog. Droog de kralen niet te drogen, omdat dit kan leiden tot een lager herstel van DNA. Haal de buizen van de magneet en voeg 17 μL 0,1x TE-buffer toe aan de kralen. Pipetteer minstens 10 keer op en neer om goed te mengen. Incubeer gedurende 2 min bij kamertemperatuur en plaats de buizen vervolgens op een magnetisch rek, waardoor kralen volledig van het supernatant kunnen scheiden. Breng 15 μL van de supernatant over naar het reinigen van nuclease-vrije PCR-buizen. Let erop dat u de kralen niet verstoort. Dit is een optioneel stoppunt in het protocol, het adaptor-ligated DNA kan worden opgeslagen bij -20 °C. 10. PCR Verrijking van Adaptor Ligated DNA Stel de PCR-reactie in zoals beschreven in tabel 9. Een Master Mix met de Pre-Capture PCR Master Mix en de Universal Primer kan worden gemaakt en toegevoegd aan het Adaptor geligat DNA. Voor multiplexed sequencing, gebruik maken van unieke index primers voor elke reactie en toe te voegen aan elk monster afzonderlijk. VERRIJKING PCR Volume (μL) Adaptor geligat DNA (Stap 10.1) 15 Pcr-mastermix vooraf vastleggen 25 Universele PCR Primer 5 Index (X) Primer 5 Totaal volume 50 Tabel 9: PCR-verrijking van adaptor geligat DNA. Componenten van de PCR-verrijking van de door de adapter geligade DNA-reactie moeten worden geassembleerd en op ijs worden gemengd op basis van de getoonde volumes. Een master mix van de Pre-Capture PCR Master Mix en de Universal PCR Primer kan worden gemaakt en toegevoegd aan de adapter geligat DNA. Voor multiplexed sequencing, elk monster moet worden gegeven een unieke Index Primer. Meng goed door voorzichtig pipetteren op en neer 10 keer. Draai de buizen kort in een microcentrifuge en plaats in een thermische fietser en voer PCR-versterking uit met behulp van Program #8 (Aanvullende tabel 2). 11. Zuivering van de PCR-reactie met Behulp van SPRI-kralen Laat SPRI Beads minstens 30 minuten voor gebruik op kamertemperatuur worden en draai vervolgens spri-kralen voor ongeveer 30 s om opnieuw op te schorten. Voeg 45 μL opnieuw gesuspendeerde kralen toe aan elke PCR-reactie (~50 μL). Meng goed door ppetteren op en neer ten minste 10 keer, alvorens uit te broeden voor 5 minuten bij kamertemperatuur. Draai de buizen kort in een microcentrifuge en plaats de buizen op een magnetisch rek om kralen van het supernatant te scheiden. Nadat de oplossing duidelijk is (~ 5 min), verwijder en gooi de supernatant zorgvuldig weg. Let erop dat u de kralen die DNA bevatten niet verstoort. Voeg 180 μL vers bereide 80% ethanol toe aan de buizen in het magnetische rek. Incubeer bij kamertemperatuur voor 30 s, en verwijder en gooi vervolgens voorzichtig de supernatant weg. Herhaal stap 11.4 eenmaal voor een totaal van 2 waspassen. Verwijder de resterende ethanol volledig. Laat de buizen op het magnetisch rek en de lucht drogen de kralen voor ongeveer 3 minuten met het deksel open, of tot zichtbaar droog. Droog de kralen niet te drogen, omdat dit kan leiden tot een lager herstel van DNA. Haal de buizen van de magneet en voeg 23 μL 0,1x TE Buffer toe aan de kralen. Pipetteer minstens 10 keer op en neer om goed te mengen. Incubeer gedurende 2 min bij kamertemperatuur. Plaats de buizen op een magnetisch rek, waardoor kralen volledig gescheiden van de supernatant. Breng 20 μL van de supernatant over naar het reinigen van nuclease-vrije PCR-buizen. Let erop dat u de kralen niet verstoort. Dit is een optioneel stoppunt in het protocol, Pre-Capture Libraries kunnen worden opgeslagen bij -20 °C. 12. Pre-capture Library valideren en kwantificeren Meet de concentratie van de pre-capture bibliotheek met behulp van een fluormeter en hoge gevoeligheid testkit. Een minimale opbrengst van 200 ng is vereist om door te gaan naar deel II: Hybridisatie en Capture. Voer 1 μL bibliotheek uit op een digitaal elektroforesesysteem. Verdun indien nodig het monster om overbelasting van de High Sensitivity Chip te voorkomen, volgens de protocolaanbevelingen van de fabrikant. Controleer of het elektropherogram een smalle verdeling vertoont met een piekgrootte van ongeveer 250-400 bp (zie representatieve resultaten, figuur 3 en figuur 4). Als een piek van 128 bp (adapter-dimer) zichtbaar is in de Bioanalyzer-sporen, en de intensiteit van het signaal ≥ de intensiteit van 250-400 bp bibliotheeksignaal is (zie representatieve resultaten, figuur 5), en vervolgens het monstervolume (van stap 11.7) naar 50 μL met 0,1x TE Buffer is en de SPRI-beadzuivering (stap 11) naar boven brengt. Dit is een optioneel stoppunt in het protocol, Pre-capture bibliotheken kunnen worden opgeslagen bij -20 °C voordat u overgaat naar deel II: ImmunoPrism Hybridization and Capture. Deel II: Hybridisatie en capture 13. Combineer het blokkeren van Oligos, Cot-1 DNA, Pre-capture Library DNA, en Dry Meng de in stap 11 opgestelde barcodebibliotheek en gekwantificeerd in stap 12, met Cot-1 DNA en Blokkeer Oligos in een nuclease-vrije PCR-buis of 1,5 mL microtube, zoals blijkt uit tabel 10. Reagens Hoeveelheid/volume Bibliotheek met streepjescode van stap 10.10 200 ng Wieg-1 DNA 2 μg Oligos blokkeren 2 μL Tabel 10: Hybridisatie Voorbereiding en afdrogen. Onderdelen die moeten worden gecombineerd voor het afdrogen van bibliotheken ter voorbereiding van hybridisatie, moeten worden geassembleerd op basis van de getoonde hoeveelheden. Droog de inhoud van de buis met behulp van een vacuümconcentrator ingesteld op 30-45 °C. Dit is een optioneel stoppunt in het protocol. Na het drogen mogen buizen ‘s nachts worden opgeslagen bij kamertemperatuur (15-25 °C) of langer bij -20 °C. 14. Hybridiseren DNA Capture Probes met de bibliotheek Ontdooi 2x Bead Wash Buffer and Hybridization Buffer, Hybridization Buffer Enhancer, ImmunoPrism Probe Panel, 10x Wash Buffer 1, 10x Wash Buffer 2, 10x Wash Buffer 3 en 10x Stringent Wash Buffer bij kamertemperatuur. Voor gebruik, inspecteer de Hybridisatiebuffer op kristallisatie van zouten. Als er kristallen aanwezig zijn, verwarm de buis op 65 °C, met tussenpozen schudden, totdat de buffer volledig is oplosbaar. Maak bij kamertemperatuur de Hybridization Master Mix in een buis. Vermenigvuldig de volumes met het aantal monsters en voeg 10% extra toe, volgende tabel 11. Hybridisatie Master Mix Volume (μL) Hybridisatiebuffer 8.5 Hybridisatie buffer versterker 2.7 ImmunoPrism Probe Panel 5 Nuclease-vrij water 0.8 Totaal volume 17 Tabel 11: Hybridization Master Mix. Componenten van Hybridization Master Mix moeten worden geassembleerd en gemengd bij kamertemperatuur op basis van de getoonde volumes. Vortex of pipette erop en neer om goed te mengen. Voeg vervolgens 17 μL van de Hybridization Master Mix toe aan elke buis met gedroogd DNA. Sluit de buizen af en incubeer 5 min bij kamertemperatuur. Vortex de monsters, ervoor te zorgen dat ze volledig worden gemengd, en draai de monsters kort in een microcentrifuge. Breng indien van toepassing elk monster over van een microbuis van 1,5 mL naar een nuclease-vrije PCR-buis. Plaats de monsters in een thermische cycler en voer Programma #9(Aanvullende tabel 2). Bereid tijdens de incubatie de wasbuffers (Stap 15) en streptavidin-kralen (stap 16) voor, waardoor voldoende tijd is om buffers voor te verwarmen en de streptavidin-kralen te equilibreren. 15. Bereid wasbuffers voor LET OP: Wasbuffers worden geleverd als 2x (Bead Wash Buffer) of 10x (alle andere wasbuffers) geconcentreerde oplossingen. Verdun tijdens de incubatievan hybridisatie de 2x Bead Wash Buffer en de 10x Wash Buffers om 1x werkende oplossingen te creëren, vermenigvuldig het vereiste aantal monsters en voeg 10% extra toe, volgende tabel 12. Als 10x wasbuffer 1 troebel is, verwarm tu de fles dan in een waterbad van 65 °C of een verwarmingsblok om deeltjes opnieuw op te schorten. Bevroren 1x Wasbuffers moeten na ontdooien worden gemengd. Buffers wassen Geconcentreerde buffer (μL) Nuclease-vrij water (μL) Totaal (μL) Kraal wasbuffer 150 150 300 Buffer wassen 1 25 225 250 Buffer wassen 2 15 135 150 Buffer wassen 3 15 135 150 Strenge wasbuffer 30 270 300 Tabel 12: Bufferverdunning wassen. De concentratiewasbuffers moeten worden verdund met nuclease-vrij water bij kamertemperatuur, afhankelijk van de getoonde volumes. Aliquot de 1x Wash Buffers in nuclease-vrije PCR buizen en plaats bij de juiste temperaturen zoals aangegeven in tabel 13. Zorg ervoor dat u voldoende overschrijding voor pipetteren. Gebruik voor verwarmde buffers een thermische cycler ingesteld op 65 °C met het deksel ingesteld op 70 °C. Buffers wassen Houdtemperatuur Volume/buis (μL) Aantal buizen/monster Kraal wasbuffer RT (15-25 °C) 100 3 Buffer wassen 1 65 °C 100 1 Buffer wassen 1 RT (15-25 °C) 150 1 Buffer wassen 2 RT (15-25 °C) 150 1 Buffer wassen 3 RT (15-25 °C) 150 1 Strenge wasbuffer 65 °C 150 2 Tabel 13: Verdunde wasbuffers. De verdunde wasbuffers moeten in afzonderlijke buizen worden genoteerd op basis van de volumes en het aantal buizen per getoond monster. Wasbuffers moeten voor gebruik op de aangegeven temperatuur worden gehouden. Bereid de Bead Resuspension Mix op kamertemperatuur zoals aangegeven in tabel 14,vermenigvuldigen met het vereiste aantal monsters en het toevoegen van 10% extra. Kraal Resuspension Mix Volume (μL) Hybridisatiebuffer 8.5 Hybridisatie buffer versterker 2.7 Nuclease-vrij water 5.8 Totaal volume 17 Tabel 14: Bead Resuspension Mix. Componenten van Bead Resuspension Mix moeten worden geassembleerd en gemengd bij kamertemperatuur op basis van de getoonde volumes. 16. Bereid de Streptavidin Kralen Equilibrate streptavidin kralen op kamertemperatuur voor ten minste 30 minuten voor gebruik. Meng de kralen grondig door vortexing voor 15 s en aliquot 50 μL kralen per vangst in een nuclease-vrije PCR buis. Voeg 100 μL 1x Bead Wash Buffer (bereid in stap 15.1) toe aan elke buis. Voorzichtig pipet op en neer 10 keer te mengen. Plaats de buis op een magnetisch rek, waardoor kralen volledig gescheiden van de supernatant. Verwijder en gooi de heldere supernatant weg. Let erop dat u de kralen niet verstoort. Voer de volgende wasuit. Haal uit het magnetische rek. Voeg 100 μL 1x Bead Wash Buffer toe aan elke buis met kralen en pipet er vervolgens 10 keer op en neer om te mengen. Plaats de buis in het magnetische rek, waardoor kralen volledig gescheiden van de supernatant. Verwijder en gooi de heldere supernatant zorgvuldig weg. Herhaal stap 16.4 eenmaal voor een totaal van twee wasbeurten. Haal uit het magnetische rek. Voeg 17 μL Bead Resuspension Mix toe vanaf stap 15.3 aan elke buis. Pipetteer meerdere malen op en neer om grondig te mengen. Zorg ervoor dat kralen niet aan de zijkanten van de buizen worden geplakt. Indien nodig, kort draai de buizen om de kralen te verzamelen aan de onderkant. 17. Bind hybridized Target aan de Streptavidin Beads Nadat de 4 uur durende incubatietijd is voltooid, verwijdert u de monsters uit de thermische fietser en stelt u de thermische fietser in op 65 °C met het verwarmde deksel ingesteld op 70 °C. Breng met behulp van een meerkanaals pipet 17 μL volledig gehomogeniseerde kralen naar de monsters. Meng grondig door 10 keer op en neer te stampen. Bind het DNA aan de kralen door de buizen in de thermische cycler te plaatsen volgens Programma #10 (Aanvullende tabel 2). Tijdens de incubatie, kort verwijderen van de strip buizen om de 10-12 min en zachtjes vortex voor 3 s om ervoor te zorgen dat de kralen blijven in suspensie. Als alternatief, mix door pipetteren op en neer meerdere malen. Ga onmiddellijk te werk naar Wash Streptavidin Beads (Stap 18). 18. Was Streptavidin kralen om ongebonden DNA te verwijderen Gebruik de 1x Wasbuffers van Stap 15.2 en bewaar verwarmde buffers in de thermische cycler tijdens wasbeurten. Voeg 100 μL voorverwarmde 1x Wasbuffer 1 toe aan de buizen vanaf stap 17.3. Meng grondig door 10 keer op en neer te stampen. Plaats de buizen op een magnetisch rek, waardoor kralen volledig gescheiden van de supernatant. Pipetteer en gooi de supernatant, die ongebonden DNA bevat. Haal uit het magnetische rek. Voer de volgende 65 °C was. Voeg 150 μL voorverwarmde 1x Stringent Wash Buffer toe. Meng grondig door pipetteren op en neer ten minste 10 keer. Vermijd bubbels tijdens het beaaiden. Zorg ervoor dat kralen volledig opnieuw zijn opgehangen in alle buizen. Incubeer in de thermische cycler bij 65 °C gedurende 5 min. Plaats de buizen op een magnetisch rek, waardoor kralen volledig gescheiden van de supernatant. Pipetteer en gooi de supernatant, die ongebonden DNA bevat. Haal uit het magnetische rek. Herhaal stap 18.4 voor een totaal van twee Stringent Washes. Voer de eerste wasbeurt op kamertemperatuur uit. Voeg 150 μL kamertemperatuur 1x Wasbuffer 1 toe. Pipetteer 10 tot 20 keer op en neer om de kralen volledig opnieuw op te schorten. Sluit de buizen af en incubeer gedurende 2 min, afwisselend tussen zacht vortexen gedurende 30 s en 30 seconden rusten. Zorg ervoor dat kralen in alle putten volledig opnieuw worden opgehangen in alle buizen gedurende de gehele incubatie. Centrifugeer de buizen kort. Plaats de buizen op een magnetisch rek, waardoor kralen volledig gescheiden van de supernatant. Pipetteer en gooi de supernatant weg. Sluit de buizen af en centrifugeer kort. Keer terug naar het magnetische rek en gebruik een 10 μl pipet om eventuele resterende wasbuffer te verwijderen. Voer de tweede kamertemperatuur wasbeurt uit. Voeg 150 μL kamertemperatuur 1x Wasbuffer 2 toe. Pipetteer 10 tot 20 keer op en neer om de kralen volledig opnieuw op te schorten. Sluit de buizen af en incubeer gedurende 2 min, afwisselend tussen zacht vortexen gedurende 30 s en 30 seconden rusten. Zorg ervoor dat kralen in alle putten volledig opnieuw worden opgehangen in alle buizen gedurende de gehele incubatie. Centrifugeer de buizen kort. Breng het volledige volume kralen opnieuw hangen in Wash Buffer 2 over om nuclease-vrije PCR-buizen schoon te maken. Belangrijk: Het overbrengen van de kralen naar verse buizen is belangrijk om off-target besmetting te voorkomen. Plaats de buizen op een magnetisch rek, waardoor kralen volledig gescheiden van de supernatant. Pipetteer en gooi de supernatant weg. Sluit de buizen af en centrifugeer kort. Keer terug naar het magnetische rek en gebruik een 10 μl pipet om eventuele resterende wasbuffer te verwijderen. Voer de derde kamertemperatuur wasbeurt uit. Voeg 150 μL kamertemperatuur 1x Wasbuffer 3 toe. Pipetteer 10 tot 20 keer op en neer om de kralen volledig opnieuw op te schorten. Sluit de buizen af en incubeer gedurende 2 min, afwisselend tussen zacht vortexen gedurende 30 s en 30 seconden rusten. Zorg ervoor dat kralen in alle putten volledig opnieuw worden opgehangen in alle buizen gedurende de gehele incubatie. Centrifugeer de buizen kort. Plaats de buizen op een magnetisch rek, waardoor kralen volledig gescheiden van de supernatant. Pipetteer en gooi de supernatant weg. Sluit de buizen af en centrifugeer kort. Keer terug naar het magnetische rek en gebruik een 10 μL pipet om eventuele resterende wasbuffer te verwijderen. Haal uit het magnetische rek en voeg 20 μL nuclease-vrij water toe aan de kralen. Pipetteer 10 keer op en neer om ervoor te zorgen dat de kralen die aan de zijkant van de buizen vastzitten, opnieuw zijn opgehangen. Belangrijk: Gooi de kralen niet weg. Gebruik de volledige 20 μL opnieuw gesuspendeerde kralen met gevangen DNA in stap 19. 19. Uitvoeren van definitieve, post-capture PCR Verrijking Bereid de Post-Capture PCR Master Mix volgens de volgende tabel, vermenigvuldigen met het vereiste aantal monsters en het toevoegen van 10% extra, volgens tabel 15. Mixcomponent pcr-master-mix na vastleggen Volume (μL) Pcr MasterMix na vastleggen 25 Post-Capture PCR Primer Mix 1.25 Nuclease-vrij water 3.75 Totaal volume 30 Tabel 15: Post-Capture PCR Master Mix. Componenten van Post-Capture PCR Master Mix moeten worden geassembleerd en gemengd op ijs volgens de getoonde volumes. Voeg 30 μL van de Post-Capture PCR Master Mix toe aan elk monster voor een eindreactievolume van 50 μL. Meng grondig door 10 keer op en neer te stampen. Plaats de PCR-buizen in de thermische cycler en incubeer volgende programma #11 (Aanvullende tabel 2). 20. Zuiveren Post-capture PCR Fragmenten Laat SPRI Beads minstens 30 minuten voor gebruik op kamertemperatuur worden en draai vervolgens spri-kralen voor ongeveer 30 s om opnieuw op te schorten. Voeg 75 μL opnieuw opgehangen kralen toe aan elke pcr-verrijkte opname (50 μL). Meng goed door pipetteren op en neer ten minste 10 keer. De streptavidin kralen zal niet interfereren met de SPRI kraal zuivering. Incubeer gedurende 5 min bij kamertemperatuur. Draai de buizen kort in een microcentrifuge en plaats de buizen op een magnetisch rek om kralen van het supernatant te scheiden. Nadat de oplossing duidelijk is, zorgvuldig verwijderen en gooi de supernatant. Wees voorzichtig niet te storen de kralen, die DNA bevatten. Voeg 180 μL vers bereide 80% ethanol toe aan de buis terwijl u in het magnetische rek zit. Incubeer bij kamertemperatuur voor 30 s, en verwijder en gooi vervolgens voorzichtig de supernatant weg. Herhaal stap 20.4 eenmaal voor een totaal van 2 waspassen. Verwijder de resterende ethanol volledig. Laat de buis op het magnetische rek en de lucht droog 3 minuten met het deksel open, of tot zichtbaar droog. Droog de kralen niet te droog. Dit kan leiden tot een lager herstel van DNA. Verwijder de buis van de magneet. Elute het DNA van de kralen door het toevoegen van 22 μL van 0,1x TE Buffer. Meng goed door pipetteren op en neer meerdere malen. Incubeer gedurende 2 min bij kamertemperatuur. Plaats de buis op het magnetische rek tot de oplossing duidelijk is. Verwijder 20 μL van de supernatant en breng over op een schone nuclease-vrije PCR-buis, oppassen dat u de kralen niet stoort. Dit is een optioneel stoppunt in het protocol, bibliotheken kunnen worden opgeslagen bij -20 °C. 21. Bibliotheek valideren en kwantificeren Meet de concentratie van de vastgelegde bibliotheek met behulp van een fluormeter en High Sensitivity Assay Kit. Meet de gemiddelde fragmentlengte van de vastgelegde bibliotheek met behulp van een digitale elektroforese DNA-chip met hoge gevoeligheid en bereken de gemiddelde fragmentgrootte voor elke bibliotheek met behulp van de systeemsoftware. De gemiddelde fragmentgrootte moet ongeveer 250-400 basiswaarde (zie representatieve resultaten, figuur 6 en figuur 7) bedragen. Dit is een optioneel stoppunt in het protocol, voltooide bibliotheken kunnen worden opgeslagen bij -20 °C. 22. Sequencing op een sequencing platform Voor sequencing, bibliotheken verdunnen tot 2 nM en volg de richtlijnen van de fabrikant voor het laden en bedienen van de sequencer. Sequentie bibliotheken tot een minimale diepte van 15 miljoen single end leest van ten minste 50 bp in lengte. 23. Analyse van sequencing-gegevens om immuunprofielen te genereren en biomarkers te ontdekken met de Prism Portal, een cloudgebaseerde informaticatool Maak een Prism-account aan door een bezoek te brengen aan https://prism.cofactorgenomics.com/ Eenmaal ingelogd, klikt u op Nieuw project verzenden op de bovenste werkbalk van een pagina in Prism om de gedemultiplexeerde FASTQ-sequencing-bestanden te uploaden of bestanden te uploaden die zijn opgeslagen op BaseSpace met het Prism-account. Vul het formulier Nieuw project in, inclusief de projectnaam, en monsters per groep of cohort. De groepering van monsters en de bijbehorende groeperingsnamen zijn nodig om het Biomarker Discovery Report te genereren. Houd er rekening mee dat minimaal 3 monsters per groep nodig zijn om het Biomarker Discovery Report te genereren. Klik op de knop Toepassing starten om het formulier in te dienen. een bevestigingspagina wordt weergegeven als dit lukt. Klik tijdens het inloggen op Resultaten weergeven op de bovenste werkbalk of op een pagina van Prism. Prism stelt een gebruiker in staat om de status van ingediende projecten te zien en voorbeeld- en biomarkerrapporten per project te bekijken. Er zal een tabel van projecten die de gebruiker heeft gemaakt op Prism. De tabel bevat drie kolommen voor de status, naam en de datum van indiening.OPMERKING: De status van elk project kan zijn:• “Hardlopen”, waar de projectanalyse momenteel wordt uitgevoerd, of• “Succes”, waarbij de projectanalyse is voltooid en rapporten beschikbaar zijn. Als een project is voltooid analyse (aangegeven door een “Succes” status), bekijk de afzonderlijke voorbeeldrapporten en een Biomarker Discovery Report. Houd er rekening mee dat het Biomarker Discovery Report alleen beschikbaar is als het project het vereiste minimum van drie monsters per groep bevat. Om toegang te krijgen tot deze rapporten, keert u terug naar de tabel met projecten en klikt u op de naam van het project. Op deze projectpagina wordt een tabel met een rij voor elk voorbeeld in het project weergegeven. Klik op de koppeling in elke rij, onder de kolom Rapport, om toegang te krijgen tot het afzonderlijke rapport van elk voorbeeld. Klik direct onder de tabel op de koppeling voor het Biomarker Discovery Report. Als er geen koppelingen op deze pagina staan, heeft uw project de analyse niet voltooid.