Использование капиллярного электрофореза иммуноанализ для поиска потенциальных биомаркеров бокового амиотрофического склероза в тромбоцитах человека
Summary
Биомаркеры на основе крови для нейродегенеративных заболеваний необходимы для проведения крупномасштабных клинических исследований. Надежный и проверенный анализ крови должен требовать небольшого объема выборки, а также быть менее инвазивным методом отбора проб, доступным и воспроизводимым. Данная статья демонстрирует, что высокопроизводительный капиллярный электрофорез иммуноанализ удовлетворяет критериям для потенциального развития биомаркеров.
Abstract
Капиллярный электрофорасиммуноз (CEI), также известный как капиллярная западная технология, становится методом выбора для скрининга заболеваний соответствующих белков и препаратов в клинических испытаниях. Воспроизводимость, чувствительность, небольшое требование объема выборки, мультиплексирующие антитела для маркировки нескольких белков в одном образце, автоматизированная высокопроизводительная способность анализировать до 24 отдельных образцов и требование короткого времени делают CEI выгодно над классическим западным иммуноанализом помот. Есть некоторые ограничения этого метода, такие как невозможность использовать градиент гель (4%-20%) матрицы, высокий фон с нерафинированными биологическими образцами и коммерческая недоступность отдельных реагентов. В этой статье описывается эффективный метод запуска CEI в нескольких параметрах анализов, оптимизация концентрации белка и первичного титрования антител в одной пластине асссе, а также предоставление удобных шаблонов для подготовки образцов. Также описаны методы измерения pan TDP-43 и фосфорилированного производного TDP-43 в цитозоле тромбоцитов в рамках инициативы по разработке биомаркеров на основе крови для нейродегенеративных заболеваний.
Introduction
Общая цель CEI, как описано здесь, заключается в предоставлении обновленного поэтапного протокола для анализа целевых белков в человеческих тромбоцитов. Назначение молекулы подписи на основе крови является одной из важнейших задач в области развития биомаркеров при нейродегенеративных заболеваниях человека, таких как болезнь Альцгеймера (АД), боковой амиотрофический склероз (ALS), фронтотемпоральный лобар дегенерации (FTLD), болезни Паркинсона (PD), включение тела миозит (IBM), и другие белковые агрегации соответствующих патологических условий. Обнаружение мельчайших количеств таких фирменных белков в больших объемах крови со многими интерферинговыми агентами является сложной задачей. Поэтому специфичность, чувствительность, способность обрабатывать большое количество образцов и воспроизводимость выбранного метода имеют решающее значение.
Человеческие тромбоциты могут служить средой для выявления и присвоения потенциальных биомаркерных белков для нейродегенеративных заболеваний. Тромбоциты предоставляют возможность служить суррогатной первичной клеточной моделью, которая отражает некоторые особенности нейрональных клеток1,2,3. Есть определенные особенности, которые делают тромбоциты одним из предпочтительных средств для анализа биомаркеров кандидатов белков и их химических производных. Во-первых, тромбоциты можно легко приобрести с помощью менее инвазивного подхода путем сбора крови от доноров (т.е. венипунктура) или в больших объемах из общинных банков крови. Во-вторых, тромбоциты можно легко изолировать от всей крови с минимальными подготовительными работами в минимально оборудованных лабораториях4,5. В-третьих, тромбоциты не имеют ядер; поэтому, они являются хорошей моделью ячейки для изучения изменений в метаболизме без транскрипционной регуляции. В-четвертых, содержание биомолекулы тромбоцитов инкапсулировано; таким образом, микросреда тромбоцитов защищает свое содержимое от веществ, мешающих сыворотке(т.е. протеаз). В-пятых, обогащенная тромбоцитами плазма может храниться при комнатной температуре в течение 7-8 дней, не теряя метаболической активности. Таким образом, тромбоциты обеспечивают рабочую модель, в которой внешние факторы минимизированы и контролируются.
Традиционные методы иммуноанализа, такие как иммуноблоттинг (например, западный промотирование) и связанный с ферментами иммуносорбент (ELISA), более широко используются в специфическом анализе белка. Однако эти два метода имеют ряд недостатков, включая несколько шагов анализа, потребность в опасных химических веществах и реагентах, большой размер выборки, проблемы с воспроизводимостью анализа и межзапускные различия в данных. Это побудило к разработке метода, который является более простым с меньшим количеством шагов и достижимым в относительно короткий период. Хотя классическая западная техника поместья останется популярным лабораторным методом, ее многоступенчатая процедура, поставки, токсичные отходы (т.е. акриламид, метанол и т.д.) и время исследования становятся менее желательными при выполнении высокопроизводительных количественных анализ белка.
Автоматизированный подход CEI постепенно становится методом выбора для лабораторий, которые проводят высокопроизводительные белковые анализы6. CEI устраняет необходимость в гелях, гелеэлектрофореза аппаратов, мембран, электрофорезиза и электро-передачи устройств, и более физического поражения обработки. Если разработан хорошо, анализ CEI должен быть завершен в пределах примерно 3,5 ч, включая количественный анализ данных, электроферограмму качества публикации и графики со статистическим анализом. Еще одним превосходством системы CEI является ее требование 10x-20x меньше концентрации белка, что делает его идеальным для использования в человеческих образцах, используемых в клинических испытаниях7,8.
Наиболее важной частью CEI является оптимизация условий ассеа для каждого антитела, приобретенного у различных поставщиков, тип антител (моноклональные против поликлональных), оптимальные концентрации белка, подготовка образца, температура денатурации образцов и электрофорезное напряжение, наносимое на капилляры. Мы разработали метод оптимизации формата единого асссеа для CEI, который должен быть реализован до проведения новых анализов, что позволит сэкономить время и ресурсы. Этот шаг оптимизации сопровождается автоматизированной количественной оценкой как общей, так и фосфорилированной производной трансактивации реакции ДНК/РНК связывающего белка (TARDP). Из-за своих размеров (43 kDa), аббревиатуру TDP-43 будет использоваться на всей этой бумаге. Здесь, TDP-43 белка в человека цизат тромбоцитов, полученных от больных ALS оцениваются, чтобы помочь развивать прогностические фосфорилирование значение (PPV) в качестве потенциального прогностического биомаркера.
TDP-43 является новым потенциальным кандидатом биомаркеров болезни для ALS. TDP-43 является вездесущим белком во всех нуклеадных клетках; Таким образом, функции TDP-43 во время различных нормальных клеточных событий и при нейродегенеративных заболеваниях были исследованы9,10,11,12,13,14. Хотя TDP-43 является ядерным белком15, он имеет возможность шаттла в и между ядром и цитоплазмой из-за присутствия ядерной локализации и ядерных последовательностей экспорта16,17,18,19. Цитоплазмический TDP-43 участвует в различных клеточных событиях, таких как стабильность мРНК и транспорт, стрессовая реакция, митохондриальная функция, аутофагосома20. Однако о роли фосфорилированных производных ТДП-43 известно не так много, кроме их участия в патогенезанейронейронии нейродегенеративного заболевания21.
Этот протокол иллюстрирует, как оптимизировать условия анализа для анализа содержимого TDP-43 и его фосфорилированной производной в тромбоцитах с использованием подхода CEI. Поскольку фосфорилированный TDP-43 не доступен на коммерческой основе, предлагается использовать прогностический фосфорилирование значение (PPV) для оценки профилей TDP-43 у пациентов с ОРВИ. Эта система CEI использует небольшой объем образцовой смеси (2,5-3,0 л на капилляр). Общая настройка объема асссена составляет 8,0 л на капилляр на основе протокола производителя; следовательно, исследователи могут использовать один образец смеси подготовки для двух отдельных работает. Производитель разработал протокол ассеа так, чтобы любые ошибки трубаций были сведены к минимуму, если не полностью устранены. 24 отдельных человека тромбоцитов лизат образца смеси делятся на половину объемов (т.е., 2,5-3,0 л на образец) и последовательно проанализированы те, два различных антител в течение 7 ч. Описанная здесь система CEI обеспечивает желаемую систему высокопроизводительных асссеа. Пользователи должны проверить антитела от различных поставщиков и образцы подготовки условий для целевого белка, прежде чем выполнять крупномасштабный скрининг.
Protocol
Representative Results
Discussion
Капиллярный электрофоретический иммуноанализ в настоящее время является методом выбора для анализа образцов с высокой пропускной стоимостью и скрининга лекарственных препаратов25. Небольшие объемы выборки, хорошо оптимизированные компоненты асссе, удобная для пользователя платформа и приборы, расходы реагентов и низкий процент резюме являются основными преимуществами26,27. Хотя существует несколько методов разделения белков в различных условиях анализа, описанный здесь CEI на основе антител может быть адаптирован небольшими лабораториями, которые занимаются разработкой биомаркеров на основе крови. Используемая здесь технология асссеирования CEI обеспечивает надежные, воспроизводимые и чувствительные измерения для TDP-4328 и его фосфорилированной производной5.
Система CEI также обеспечивает мультиплексный выбор анализа TDP-43 и его фосфорилированных производных одновременно и обеспечения прямой количественной оценки целевого белка, если имеется очищенный или рекомбинантный целевой белок. Полнометражный рекомбинантный белок TDP-43 доступен на коммерческой основе; однако рекомбинантный фосфорилированный производный TDP-43 не является. Поскольку фосфорилированный TDP-43 не является коммерчески доступным, для оценки профиля TDP-43 у пациентов с ОРВив было внедрено значение прогнозного фосфорилирования (PPV). Пан TDP-43 и фосфорилированные количества TDP-43 постоянно маркировались флюорофором; таким образом, профиль TDP-43 остается неизменным с количественной единицей или без нее (т.е. ng/mL, pg/mL и т.д.). Хотя определение абсолютного количества TDP-43 и его фосфорилированных производных (т.е. P (S409-410-12) TDP-43 обеспечивает более количественное измерение, расчет PPV устраняет необходимость рекомбинантного фосфорилированного TDP-43 для стандартизации, так как он не является коммерчески доступным.
CEI предоставляет несколько контрольно-пропускных пунктов на платформе ассеидля для точного определения проблемы в случае сбоя в ассе. Это устраняет препятствия и обеспечивает лучший экспериментальный дизайн. Процедура асссеа полностью автоматизирована, за исключением заполнения образца пластины. Это существенная особенность по сравнению со стандартным западным анализом промотирования. Эта функция обеспечивает согласованность от запуска к перспективе. Хотя каждая лаборатория имеет уникальные стандартные операционные процедуры, важно придерживаться практики, которые сводят к минимуму человеческие ошибки. Например, очень важно подготовить люминол-S/ перекись смеси непосредственно перед пластиной нагрузки, так как добавление перекиси в люминол начинает ферментативную реакцию и потребляет субстрат люминола. Загрузка образцов и первичных/вторичных антител в плитные колодцы без пузырьков воздуха также являются критически важными шагами.
Кроме того, поскольку пластины скважины малы по объему и нет места между скважинами, пользователи должны соблюдать осторожность во время pipetting, который является наиболее важным шагом, поскольку все остальное автоматизировано. Порядок загрузки образцов, антител и других реагентов важен для согласованности асссеа(рисунок 1). Процесс приготовления пластины занимает около 40-45 мин. Поэтому рекомендуется сначала загрузить пластину необходимыми компонентами ассеиума и подготовить люминол-S/перекись смеси непосредственно перед пипеткой. Таким образом, существует последовательная последовательность добавления реагента, и последовательная сила сигнала люминесценции будет достигнута. Не рекомендуется использовать просроченный люминол-S/перекись, так как это в первую очередь влияет на прочность перекиси. Недавний прогресс в внедрении системы сплит-буфера, включая диапазон совместимость химических веществ и моющих средств, повысил качество анализов и дал более воспроизводимые и предсказуемые результаты. Теперь, новый комбо-анализатор от того же производителя обладает функцией для анализа образцов помечены хемилюминесценции и флуоресценции конъюгированных антител в том же запуске. Эта новая функция устраняет необходимость последовательного запуска двух отдельных пластин и устраняет забегов.
Пластины ассеа должны храниться при температуре окружающей среды. Если он выбран, чтобы держать ассеа пластины в холодильнике 4 кв, пластины должны быть вывезены в ночь перед проверкой и доведены до температуры окружающей среды. Неправильно загруженные образец скважины должны быть широко (4-5 раз) промываются с буфером, предусмотренным в комплекте, прежде чем добавить правильный образец. Каждый первичный антитела и биологические образцы уникальны; поэтому, антитела / оптимизация белка должна быть выполнена перед анализом образцов для целевых белков в биологических жидкостях.
Здесь основное время инкубации антител было установлено в течение 30 минут по умолчанию. Если сигнал слабый, пользователи должны рассмотреть вопрос об увеличении времени первичной инкубации антител до достижения желаемой силы сигнала без флуоресценции сигнала выгорания. Для человеческих тромбоцитов были подготовлены и использованы объединенные образцы пациентов для оптимизации. Объединение образцов лучше представляет собой вариацию между целевыми биомолекулами. Для CEI рекомендуется использовать четкие супернатанты, а не тотальный лизат или тотальный гоменат.
Высокая концентрация белка в цельной смеси лизата тромбоцитов может уменьшить соотношение сигнала к шуму(рисунок 2). Следует избегать повторных циклов замораживания-оттепели образцов, так как это отрицательно сказывается на первичных связываниях антител. Ингредиенты лизатного буфера имеют важное значение, так как некоторые реагенты не совместимы с CEI29. Перед подготовкой образца рекомендуется перепроверить перечень совместимых реагентов, представленных на сайте производителя. Это ограничение системы, которая не допускает высоких условий строгости для подготовки образца. Рекомендуется оптимизировать параметры бега анализа (т.е. первичного разбавления антител, концентрации белка, времени инкубации первичных антител и т.д.) с использованием объединенных образцов для последующего анализа отдельных образцов.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было организовано интрамуральным грантом, присуждаемым А.А. Эта работа была поддержана грантом CTSA от NCATS, присужденным Медицинскому центру по граньрам Университета Канзаса: Институту клинических и трансляционных исследований Хартленда (#UL1TR606381). Содержание исключительно несет ответственность авторов и не обязательно отражает официальные взгляды NIH или NCATS. Мы благодарны за Университет Канзаса Медицинский центр ALS клиники личного для получения IRB утверждения для сбора образцов крови от здоровых добровольцев и больных ALS. Авторы благодарят Эмре Агбаса за коррективы рукописи.
Materials
| 12-230 kDa Separation kit | ProteinSimple | SM-W004 | Contains pre-filled assay plate and 25-channel capillary cartridge |
| 3000G Thermocycler | Techne | FTC3G/02 | We used this thermocylcer for heating the sample mix |
| Anti-Mouse detection kit | ProteinSimple | 042-205 | Includes HRP-conjugated secondary antibody, buffer, luminol reagent, molecular weight marker |
| Anti-P(S409-410) TDP-43 antibody | ProteinTech | 22309-1-AP | Primary antibody that recognizes phosphorylated TDP-43 |
| Anti-P(S409-412) TDP-43 antibody | CosmoBio-USA | TIP-PTD-P02 | Primary antibody that recognizes phosphorylated TDP-43 |
| Anti-Rabbit detection kit | ProteinSimple | DM-001 | Includes HRP-conjugated secondary antibody, buffer, luminol reagent, molecular weight marker |
| Anti-TDP-43 (pan) antibody | ProteinTech | 10782-2-AP | Primary antibody that recognizes whole TDP-43 protein |
| Compass for SimpleWestern (SW) | ProteinSimple | Ver.4.0.0. | Compass for SW is the control and data analysis application for SimpleWestern instruments |
| Sonic Dismembrator; Model100 | Fisher Scientific | Sonicator. Used to rupture the cell membrane. This model is discontinued (Model XL2000-350) | |
| Table top centrifuge | Eppendorf | 22625004 | Model# 5810 with swinging plate bucket |
| Wes analyzer | ProteinSimple | 55892-WS-2203 | Performs the capillary gel electrophoresis |
References
- Blair, P., Flaumenhaft, R. Platelet alpha-granules: basic biology and clinical correlates. Blood Reviews. 23 (4), 177-189 (2009).
- Mercado, C. P., Kilic, F. Molecular mechanisms of SERT in platelets: regulation of plasma serotonin levels. Molecular Interventions. 10 (4), 231-241 (2010).
- Goubau, C., et al. Regulated granule trafficking in platelets and neurons: a common molecular machinery. European Journal of Paediatric Neurology. 17 (2), 117-125 (2013).
- Basu, S. S., et al. Human platelets as a platform to monitor metabolic biomarkers using stable isotopes and LC-MS. Bioanalysis. 5 (24), 3009-3021 (2013).
- Wilhite, R., et al. Platelet phosphorylated TDP-43: an exploratory study for a peripheral surrogate biomarker development for Alzheimer’s disease. Future Science OA. 3 (4), 238 (2017).
- Worth, A. J., et al. LC-MS Analysis of Human Platelets as a Platform for Studying Mitochondrial Metabolism. Journal of Visualized Experiments. (110), e53941 (2016).
- Statland, J. M., et al. Rasagiline for amyotrophic lateral sclerosis: A randomized, controlled trial. Muscle and Nerve. 59 (2), 201-207 (2019).
- Charytan, D. M., et al. Safety and cardiovascular efficacy of spironolactone in dialysis-dependent ESRD (SPin-D): a randomized, placebo-controlled, multiple dosage trial. Kidney International. 95 (4), 973-982 (2019).
- Ugras, S. E., Shorter, J. RNA-Binding Proteins in Amyotrophic Lateral Sclerosis and Neurodegeneration. Neurology Research International. , 432780 (2012).
- Amador-Ortiz, C., et al. TDP-43 immunoreactivity in hippocampal sclerosis and Alzheimer’s disease. Annal of Neurology. 61 (5), 435-445 (2007).
- Baloh, R. H. TDP-43: the relationship between protein aggregation and neurodegeneration in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal lobar degeneration. FEBS Journal. 278 (19), 3539-3549 (2011).
- Buratti, E., Baralle, F. E. The molecular links between TDP-43 dysfunction and neurodegeneration. Advances in Genetics. 66, 1-34 (2009).
- Guo, W., et al. An ALS-associated mutation affecting TDP-43 enhances protein aggregation, fibril formation and neurotoxicity. Nature Structural Molecular Biology. 18 (7), 822-830 (2011).
- Geser, F., et al. Motor neuron disease clinically limited to the lower motor neuron is a diffuse TDP-43 proteinopathy. Acta Neuropathologica. 121 (4), 509-517 (2011).
- Neumann, M., et al. Ubiquitinated TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis. Science. 314 (5796), 130-133 (2006).
- Buratti, E., Baralle, F. E. TDP-43: gumming up neurons through protein-protein and protein-RNA interactions. Trends in Biochemical Sciences. 37 (6), 237-247 (2012).
- Fallini, C., Bassell, G. J., Rossoll, W. The ALS disease protein TDP-43 is actively transported in motor neuron axons and regulates axon outgrowth. Human Molecular Genetics. 21 (16), 3703-3718 (2012).
- Ayala, Y. M., et al. Structural determinants of the cellular localization and shuttling of TDP-43. Journal of Cell Sciences. 121, 3778-3785 (2008).
- Fiesel, F. C., Kahle, P. J. TDP-43 and FUS/TLS: cellular functions and implications for neurodegeneration. FEBS Journal. 278 (19), 3550-3568 (2011).
- Birsa, N., Bentham, M. P., Fratta, P. Cytoplasmic functions of TDP-43 and FUS and their role in ALS. Seminars in Cell and Development Biology. , (2019).
- Liachko, N. F., et al. CDC7 inhibition blocks pathological TDP-43 phosphorylation and neurodegeneration. Annals of Neurology. 74 (1), 39-52 (2013).
- Qureshi, A. H., et al. Proteomic and phospho-proteomic profile of human platelets in basal, resting state: insights into integrin signaling. PLoS One. 4 (10), 7627 (2009).
- Suominen, I., Koivisto, S. Increasing Precision When Pipetting Protein Samples: Assessing Reliability of the Reverse Pipetting Technique. American Laboratory. , (2011).
- . Pipetting tool box for life sciences Available from: https://www.mt.com/us/en/home/library/guides/laboratory-division/life-science/pipetting-toolbox-for-life-sciences.html (2019)
- Hale, L. J., et al. 3D organoid-derived human glomeruli for personalised podocyte disease modelling and drug screening. Nature Communication. 9 (1), 5167 (2018).
- Chen, J. Q., Wakefield, L. M., Goldstein, D. J. Capillary nano-immunoassays: advancing quantitative proteomics analysis, biomarker assessment, and molecular diagnostics. Journal of Translational Medicine. 13, 182 (2015).
- Moser, A. C., Hage, D. S. Capillary electrophoresis-based immunoassays: principles and quantitative applications. Electrophoresis. 29 (16), 3279-3295 (2008).
- Fourier, A., et al. Development of an automated capillary nano-immunoassay-Simple Western assay-to quantify total TDP43 protein in human platelet samples. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (1), 267-275 (2019).
- . Compatibility, S.W.S.A.B Available from: https://www.proteinsimple.com/technical_library.html (2017)
