ヒト血小板における筋萎縮性側索硬化症の潜在的バイオマーカーを探索するためのキャピラリー電気泳動免疫学的研究法の使用

ヒト血小板の処理に関するすべてのプロトコルは、カンザス大学医療センターとカンザスシティ医科大学とバイオサイエンスIRB委員会の両方のガイドラインに従います。 1. バッファーおよび試薬の調製 メモ:メーカーのガイドラインに従って、すべてのサンプルを準備してください。この手順では、個人用保護装置(ラボコート、手袋、ゴーグル)を着用してください。 0.941 gのスクロース(11 mM最終濃度)、6.4 mLの5 M NaCl(128 mM決勝)、5.4 mL0.2M NaH 2 PO 4(4.3 m)を組み合わせてクエン酸洗浄バッファーを調製します。 Mファイナル)、0.2 M Na2PHO4(7.5 mM決勝)、0.352gのクエン酸ナトリウム(4.8mM決勝)、0.115gのクエン酸(2.4mM決勝)の9.4mL。0.45 μm フィルターディスクを使用して ddH2O. フィルターを使用して総体積を 250 mL に調整し、pH を 6.5 に調整します。4°Cで1年まで保管してください。使用する前に、溶液室温(RT)を22にしてください。 100 mL の最終ボリュームで 250 mM スクロース、1 mM EDTA、10 mM Tris-Cl (pH 7.4) を組み合わせて、破裂バッファーを準備します。4°Cで1年まで保管してください。2 μL のホスファターゼ阻害剤カクテル (1:1000 最終) と 1 μL のプロテアーゼ阻害剤カクテル (1:2000 最終) を 2 mL の破裂バッファーに加えます。使用するまで氷の上に保管してください。未使用の破裂バッファを破棄します。 2. 血小板分離 酸クエン酸デキストロース(ACD)溶液(75 mMクエン酸三ナトリウム、124 mMデキストロース、38 mMクエン酸、pH = 7.4)を含むイエローキャップ採血チューブで8~10 mLのヒト血液を採取。ACD:血液 = 1:9)。チューブの内容を 5x~6x の反転を手で軽く混ぜます。 RTで20分間スイングバケットローターで200 x gでチューブを遠心分離します。 血小板が豊富なプラズマ(PRP)(約3~4mL)を15mLの円錐形の底管に集め、汚染を避けるために、バフィーコート(かすんだ画分)から約0.5mLのPRPを残します。赤血球の汚染が発生した場合は、この手順を繰り返します。 RTで15分間、1,200 x gでPRPサンプルを遠心分離します。 血小板ペレット(P1)をクエン酸洗浄緩衝液1mLで穏やかに再懸濁し、RTで15分間1,200 x gで遠心分離してペレットを洗浄します。 純粋な血小板ペレットを保存します。上清を捨てます。 阻害剤カクテルを含む破裂バッファーの600μLで血小板ペレットを再懸濁する。 ソネケーターを使用して血小板懸濁液を超音波処理します。サンプルをミニアイスバケツに入れる。連続モードで20 sの設定3でソニエーターを設定します。注:プローブを10%漂白剤で洗浄し、その後に蒸留水を必ずおきます。 超音波処理されたサンプルを4°Cで30分間20,000 x gで遠心分離し、膜分画を除去します。アリコート上清は60μLで、-80°Cで保存します。血小板細胞の分画の繰り返しの解凍/凍結サイクルを避ける. 3. CEIの準備 注:ALS患者(n=8-10)から100μLのヒト血小板ライセートを組み合わせ、健康な被験者(n =8-10)を別々にプールし、アッセイの最適化に使用した。 CEI レイアウト用の社内で生成されたテンプレート (表 1) およびサンプル準備 ( 表2) を記入します。サンプル混合調製テーブルは動的で、ソースから除去する必要があるボリュームの量を自動的に計算します。注: 動的 Table-2 に入力された必要なソースボリュームの場合、0.1 X サンプルバッファボリュームが自動的に計算されます。 キャピラリーを備えた25 0.2 mL PCRチューブをプリラベル#1-#25し、PCRラックに入れられます。氷の上に置く。 前ラベル0.6 mLマイクロ遠心チューブ:使用する一次抗体および希釈(必要な場合)ごとに1つ、0.1xサンプルバッファー用に1つ、ルミノール-S/ペルオキシド用に1つ、および各サンプルに1つずつ希釈する(必要な場合)。チューブラックの氷の上に置きます。 CEI分離12~230kDaマスターキット分離モジュールに備えたサンプルバッファー、洗浄バッファー、1プレート、カートリッジを取り出します。 4°C冷却装置から、抗体希釈バッファー、一次抗体、二次抗体、ルミノール、過酸化水素、および標準パックを取り出す。RTに残っている標準パックを除くすべての試薬を氷の上に置きます。注:標準パックの試薬は凍結乾燥され、ホイルカバーで密封されています。これらは、製品の損失を減らすために開く前に、ミニ遠心分離機を使用して短時間スピンダウンする必要があります。開くには、試薬チューブはピペット先端で突き刺すか、コーナーから引き戻すことができます。 400 mM DTT を準備するには、DTT を含む透明なチューブに 40 μL の脱イオン水を加えます。 40 μL の蛍光 5x マスターミックスを準備するには、キットに用意されたピンクのチューブに、10x サンプル バッファーの 20 μL と準備した 400 mM DTT 溶液の 20 μL を加えます。 ビオチン化ラダーを準備するために、16 μLの脱イオン水、2μLの10xサンプルバッファ、およびキットに用意された白いチューブに調製した400mM DTT溶液の2μLを加えます。穏やかに混ぜ、変性のために0.2 mL PCRの管に移す。 1.5 μLの10μLのサンプルバッファと148.5 μLの脱イオン水を0.6 mLマイクロ遠心管に加えて、0.1xサンプルバッファを調製します。氷の上に混ぜて置くために渦。 所望の抗体希釈液を調製する。事前標識されたマイクロ遠心チューブに指定された量に抗体希釈剤を添加します。ボリュームが同じ場合は、逆ピペット化テクニック23を使用します。そうでなければ、分配する前にピペットチップを事前にすすいでください。注:このアッセイでは、a-TDP-43パン抗体およびa-p(S409/410-2)TDP-43抗体が使用されました。抗ERK抗体は、アッセイ成分が働いていることを確認するために内部制御に使用されました。 後述する抗体希釈に対して逆ピペッティングを行う。あるいは、追加情報は文献24に記載されている。注:逆ピペット法は、ソリューション23の小さな連続ボリュームを分配する場合に適しています。この技術は、(i)正確な容積を提供し、(ii)先端オリフィスの試薬発泡を排除し、(iii)少量(<5 μL)試薬、粘性溶液、界面活性剤、高蒸気圧を有する溶液に最適です。 ピペットに適切なチップを入れ、プランジャーを2番目のストップまで押します(ステップ-2)。ピペットチップを数ミリメートル浸して溶液に入します。チップが溶液に浸漬されている間、ゆっくりとプランジャーを放してピペットチップを溶液で満たします。溶液から先端を取り出し、試薬貯蔵所の端にそっと触れ、先端の外側に残った余分な液体を除去します。 プランジャを押して最初のストップにして溶液を分配します(ステップ-1)。先端に残りの溶液を分配しないでください。 プランジャーを第2の停止に押し込んで、試薬貯留層への先端の残りの溶液を空にします(ステップ-2)。プランジャを次のピペッティングステップの準備完了位置に放します。 事前標識されたマイクロ遠心チューブに指定されたボリュームに必要な抗体を追加する (表 1)ピペット先端を前リンスしないでください: 希釈剤に直接追加し、チップを複数回フラッシュして抗体を除去します。チューブを氷の上に置きます。 CEI サンプルミックスを準備するには、cap#2 から cap#25 までのラベルが付いた PCR チューブに対して以下の手順を実行します。 すべてのチューブを開き、逆ピペット法を用いて各チューブに蛍光5xサンプルバッファーの1.6 μLアリコートを加え、5xバッファーを加えた際に各PCRチューブを閉じてサンプル損失を最小限に抑えます。 すべてのチューブを開き、表2に示すボリュームで0.1xサンプルバッファを各チューブに追加し、その後すぐに閉じます。ボリュームが同じ場合は、逆ピペッティング手法を使用します。そうでなければ、0.1xサンプルバッファを分配する前にプリリンスピップチップ。 すべてのチューブを開き、表2に指定された量のタンパク質サンプルを各チューブに加え、その後すぐに閉じます。ボリュームが同じ場合は、逆ピペット法を使用します。そうでなければ、0.1xサンプルバッファを分配する前にプリリンスピップチップ。 ベンチトップ遠心分離機(13,000 x g、30 s)ですべてのPCRチューブを簡単に遠心分離し、フリック/ボルテックスPCRチューブを混合し、遠心分離を繰り返します。 すべての PCR チューブを熱い蓋でサーモサイクラーに移します。定義された温度と持続時間(すなわち、5分間95°C、10分間70°C)でサンプルを変性させる。注:変性温度と持続時間は、標的タンパク質に最適化する必要があります。 手順 3.12.4 を繰り返します。 すべての PCR チューブをチューブ ラックに戻し、氷の上に置きます。 変性工程の間に、現像液(1:1ルミノール-S:過酸化物溶液)を調製し、ルミノール-Sの200μLと過酸化物の200μLを加えます。氷の上に置きます。 上記で準備したサンプルを備えたCEIプリフィルプレートをロードするには、試薬およびサンプルをアッセイレイアウトに示すアッセイプレートに分配します(図1)。気泡の導入は避けてください。注: ボリュームとソリューションが同一の場合は、逆ピペット法を使用します。そうでなければ、分配する前にピペット先端を前にすすい、ピペットの2番目のタブストップを使用してプレートによく残りを排出しないでください。12~230 kDaの分離モジュールには、色分けされたプレートローディングガイドが含まれている場合があります。このガイドをプレートの下に置き、試薬やサンプルをウェルに加え、サンプルのロード時に視覚的に役立ちます。プレートローディングガイドは、会社のウェブサイトからもダウンロードできます。 行Eに、各ウェルに15μLのルミノール:過酸化物ミックスを加えます。注:理想的には、使用の直前にこの試薬を準備し、各ウェルに追加します。これが都合が悪い場合、この混合物はプレートローディングの前に30分以内に調製されてもよい。 行 D に、よく D1 に、ストレプトアビジン-HRP の 10 μL を追加します。 行Dに、ウェルD2〜D25に、指定された二次抗体の10 μLを加える。 行Bに、各ウェルに、10μLの抗体希釈剤を加える。 行Cに、よくC1に、10μLの抗体希釈剤を加える。 行Cで、ウェルC2〜C25に、指定された一次抗体の10 μLを加える。 行Aに、よくA1に、PCRチューブから5μLのビオチン化ラダーを#1加える。 A 行 A で、A2 –A25 をウェルするために、3 μL のサンプルを加えて、PCR チューブ #2 – #25を対応するウェル #2 – #25に追加します。 各指定の洗浄バッファーウェルに 500 μL の洗浄バッファーを追加します。 RTで1,000 x gで5分間プレートを遠心分離します。 図1:アッセイレイアウト。一次抗体と標的タンパク質サンプルの両方の最適化は、1つのアッセイで行うことができる。毛細血管2~7、8–13、14-19、および20-24は、様々なタンパク質濃度および一次抗体範囲を表します。毛細管25は陽性対照を表す。抗ERK抗体を使用した;ただし、適切な正の制御を含めることができます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 4. CEI をプレート 1 で実行する まず、CEI (材料表) アナライザーをオンにしてから、コンピュータの電源を入れます。ソフトウェアを開く (資料のテーブル) アナライザーをオンラインシステムに接続します (マテリアルのテーブル)。これは、トラブルシューティングやデータ復旧のトラブルのために実行データを収集するために必要な手順です。 左上のメニューから[インストゥルメント]をクリックし、[接続]をクリックします。ポップアップメニューとして表示される計測器シリアル番号を選択します。[接続] をクリックします。 「アッセイ」タブを選択し、「新規アッセイ」を選択するか、保存したテンプレートを選択します。 入力アッセイパラメータ (表1)または現在テンプレートを変更します。ファイル名と場所を保存します。 アナライザーの青い点滅インジケータが青色の点灯を確認します。 オレンジ色のドアの上にある銀色の金属ボタンをタッチして開きます。 乳管カートリッジを慎重に取り外します。製造元のプロトコルの説明に従ってキャピラリーカートリッジを挿入します。正しく取り付ければ、内部ライトが「青」に変わります。 アッセイプレートから保護シールを取り外します。気泡の充填済み井戸を目視で観察します。観察された場合は、小さなピペットチップでそれらをポップ(ロングシャフトP10ピペットチップがうまく動作します)。 アッセイプレートを置いてプレートホルダーを積み込み、ドアを閉めます。コンピュータで、[スタート]ボタンをクリックします。 温度に敏感な試薬とサンプルを入れた氷トレイを、2番目のプリフィルプレートを準備する準備ができるまで、4°Cの暗闇の中に置きます。 試薬/供給物は、2番目のプレートの室温で放置します。 5. CEIをプレート2で行う 注:この版はリン酸化されたTDP-43のレベルを分析するために設定される。 4°Cで保存されている氷トレイを取り外し、ベンチに1時間、最初のプレートの推定完了時間の前に置きます。2 番目のプレートとカートリッジを取り出します。 2回目の走行に必要な抗体希釈液を準備し、氷の上に保管します。新鮮な1:1ルミノール-S:過酸化物溶液を準備します(上記のステップ3.12.8)。 サンプルミックスとプリフィルプレートを装填するために必要な試薬をリミックスし、一時的に再遠心分離します。図 1に従って 2 番目のプレートをロードします。a-p(S409-410-2) TDP-43抗体溶液を行Cウェルにロードします。 最初の実行が完了したら、最初のプレートとカートリッジを破棄します。カートリッジを取り外し、削り取った容器に入れ、廃棄します。参照目的のために、プレートとカートリッジからステッカーを保管してください。 ソフトウェア ファイルを閉じて、同じテンプレートを再度選択します。ソフトウェアは、以前の実行からの設定を記憶します。必要に応じて注釈を変更します(つまり、一次抗体を変更します)。 手順 4.8 ~ 4.10 を繰り返します。12~230 kDaのマスターキット分離モジュールの試薬と消耗品をすべて片付ける CEIサンプルミックス、抗体希釈、0.1xサンプルバッファー、ルミノール-S:ペルオキシドの残りは大学の規制に従って廃棄されます。 6. データ分析 実行が完了したら、次の品質チェックが実行されていることを確認します。 ソフトウェアで、[標準を表示]アイコンとグラフ表示タブを選択します。[標準を強制]を選択するか、誤ったピークを右クリックして[標準ではない]を選択して、不整列を修正します。新しいキャピラリーごとにこのチェックを実行します。 サンプルとシングルビューアイコンをクリックします。実験タブで毛細管#1(ビオチン化されたはしご)を選択します。ソフトウェアによってピークの選択が正しくない場合は、グラフビューでピークをクリックし、[ピークを削除]を選択します。注: 例として、12-230 KDa ビオチン化されたラダーは、12 kDa、40 kDa、66 kDa、116 kDa、180 kDa、および 230 kDa でサイジングピークを示します。この手順を実行しないと、サンプルピークのサイズが正しく設定されず、不正確な結果が生成されます。 電気泳動ムービーを表示し、実行中に異常な移動が発生したかどうかを確認します。 必要に応じて、必要に応じてデータ(たとえば、分子量、ピーク面積、ピーク高さ、信号対ノイズ[S/N]を含むピーク表)を導出します。グラフの詳細を表示するためのグラフ注釈ツールは、グラフウィンドウの右上隅にあります。