JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscience

שימוש של אלקטרופורזה נימי הנוגדנים כדי לחפש בסמנים פוטנציאליים של טרשת Amyotrophic לרוחב בטסיות האדם

Published: February 10, 2020
doi:
10.3791/60638
, , , , , , ,
1Department of Basic Sciences,Kansas City University of Medicine and Biosciences, 2Rice University School of Medicine, 3University of Kansas Medical Center

Summary

בדיקות דם מבוססות עבור מחלות ניווניות חיוניים ליישום מחקרים קליניים בקנה מידה גדול. בדיקת דם אמינה ומאומתת צריך לדרוש נפח דגימה קטן, כמו גם להיות שיטת דגימה פחות פולשנית, במחיר סביר, והניתן לקריאה. נייר זה מדגים כי התפוקה הגבוהה של אלקטרופורזה באמצעות נימי הכוח מספקת את הקריטריונים להתפתחות ביואלית פוטנציאלית.

Abstract

הטיפול החיסוני נימי (CEI), הידוע גם בשם הטכנולוגיה המערבית קפילר, הופך לשיטה של בחירה עבור מחלות סינון חלבונים רלוונטיים ותרופות בניסויים קליניים. הניתן לגילוי, רגישות, נפח קטן לדוגמה דרישה, נוגדנים ריבוב עבור תוויות חלבון מרובות במדגם זהה, אוטומטי היכולת תפוקה גבוהה לנתח עד 24 דגימות בודדות, ואת הדרישה זמן קצר להפוך CEI יתרון על שיטת החיסוני המערבית הקלאסית. ישנן מספר מגבלות של שיטה זו, כגון חוסר יכולת לנצל ג’ל מעבר צבע (4% – 20%) מטריצה, רקע גבוה עם דגימות ביולוגיות מזוקק, וחוסר זמינות מסחרית של ריאגנטים בודדים. נייר זה מתאר שיטה יעילה להפעלת CEI בקביעת מספר רב של מיטוב, אופטימיזציה של ריכוז החלבון והנוגדן הראשוני בצלחת הספק, ומספקת תבניות ידידותיות למשתמש להכנה לדוגמה. גם תיאר הן שיטות למדידת פאן TDP-43 ו-TDP זרחני-43 נגזרות של טסיות ליפוסט, במסגרת היוזמה בפיתוח ביוארקר דם מבוסס על מחלות ניווניות.

Introduction

המטרה הכוללת של CEI כפי שמתואר כאן היא לספק פרוטוקול חורג מעודכן לניתוח חלבונים היעד של טסיות האדם. הקצאה של מולקולה חתימה מבוססת דם היא אחת המשימות החשובות ביותר בתחום של פיתוח ביואריקר במחלות ניווניות האדם, כגון מחלת אלצהיימר (AD), amyotrophic לרוחב טרשת נפוצה (ALS), אוני הטמפורלית ניוון (ftld), מחלת פרקינסון (PD), הכללת ומבגו (IBM), ושאר התנאים הפתולוגית לצבירת חלבונים הרלוונטיים. זיהוי של כמויות דקות של חלבונים כגון חתימה בכמויות גדולות של דם עם סוכנים רבים מפריעים הוא אתגר. לכן, הספציפיות, הרגישות, היכולת להתמודד עם מספר רב של דגימות, והיעדר האפשרות של השיטה שנבחרה הם קריטיים.

טסיות האדם יכול לשמש כסביבה לזהות ולהקצות חלבונים בסמנים פוטנציאליים עבור מחלות ניווניות. טסיות לספק את ההזדמנות לשמש מודל מחליף תא הראשי, אשר משקפים כמה תכונות של תאים עצביים1,2,3. יש תכונות מסוימות העושות טסיות אחד האמצעים המועדפת כדי לנתח חלבונים המועמד מועמדים ונגזרות כימיים שלהם. ראשון, טסיות ניתן לרכוש בקלות באמצעות גישה פחות פולשנית על ידי איסוף דם מתורמים (כלומר, לנקב) או בכמויות גדולות מבנקים דם הקהילה. שנית, טסיות ניתן לבודד בקלות מן הדם כולו עם עבודת הכנה מינימלית במעבדות מצויד מינימלית4,5. שלישית, טסיות אין גרעין; לכן, הם תא מודל טוב ללמוד שינויים בחילוף החומרים ללא התקנה הטרנססקריפט. רביעית, התוכן הסמנים של טסיות הוא אנקפסולציה; לכן, הסביבה מיקרוטסיות מגן על תוכנו מפני חומרים מפריעים סרום (כלומר, הפרוטסים). פלזמה חמישית, טסיות מועשר ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר במשך 7 – 8 ימים מבלי לאבד פעילות מטבולית. לכן, טסיות לספק מודל עובד שבו גורמים חיצוניים ממוזערים ומבוקרת.

שיטות חיסוני מסורתיות כגון מעטפת חיסונית (למשל, בלופים מערביים) ושיטת חיסוני מקושרת של אנזימים (אליסה) משמשות יותר בניתוח חלבונים ספציפי. עם זאת, שתי שיטות אלה יש מספר חסרונות, כולל מספר שלבי מידע, הדרישה של כימיקלים מסוכנים ריאגנטים, גודל דגימה גדולה, בעיות עם שינוי ביכולת הנתונים, ובין הפעלה מושתנים מידע. אלה התבקשו להתפתחות של שיטה פשוטה יותר עם פחות צעדים והשגה בתקופה קצרה יחסית. למרות שטכניקת האבן המערבית הקלאסית תישאר שיטת מעבדה פופולרית, הליך רב-השלבים שלה, אספקה, פסולת רעילה (כלומר, אקרילאמיד, מתנול וכו ‘) וזמן הטיפול הופכים להיות פחות רצויים בעת ביצוע תפוקה גבוהה כמותית . ניתוח חלבונים

הגישה CEI אוטומטי הוא הופך בהדרגה שיטה של בחירה עבור מעבדות המבצעות תפוקת התפוקה גבוהה חלבון אומר6. CEI מבטלת את הצורך ג’ל, אלקטרופורזה ג’ל מכשירים, ממברנות, אלקטרופורזה והעברת התקנים אלקטרו, וטיפול פיזי עורבות. אם תוכננה היטב, יש להשלים את מערך CEI בתוך כ 3.5 h, כולל ניתוח נתונים כמותי, electropherogram באיכות הפרסום וגרפים בעלי אנליזה סטטיסטית. עליונות נוספת של מערכת cei היא הדרישה של 10x-20x פחות ריכוז החלבון, מה שהופך אותו אידיאלי לשימוש בדגימות אנושיות בשימוש בניסויים קליניים7,8.

החלק הקריטי ביותר של CEI הוא אופטימיזציה של תנאי הטיפול עבור כל נוגדן שנרכשו מספקים שונים, סוג של נוגדן (חד שבטיים לעומת polyclonal בטים), ריכוז החלבון האופטימלי, הכנה לדוגמה, הטמפרטורה מדגם לדוגמה, ומתח האלקטרופורזה מוחל על נימים. פיתחנו שיטת מיטוב בתבנית יחידה עבור CEI שצריך להיות מיושם לפני כל assays חדש, אשר יחסוך זמן ומשאבים. צעד זה אופטימיזציה ואחריו הערכה כמותית אוטומטית של נגזרים הכולל והזרחתית של התגובה הטרנסניתית של DNA/RNA כריכת חלבון (TARDP). בשל גודלו (43 kDa), ראשי התיבות TDP-43 ישמשו לאורך הנייר הזה. כאן, TDP-43 חלבון בטסיות הדם האנושית ליפוסט המתקבל מהחולים ALS מוערך כדי לעזור לפתח ערך זרחון חזוי (PPV) כמו בסמנים פוטנציאליים התחזיות.

TDP-43 הוא מועמד פוטנציאלי מחלה חדשה ביוארקר עבור ALS. TDP-43 הוא חלבון בכל מועד בכל התאים הנוקלאווניים; לכן, את הפונקציות של tdp-43 במהלך שונות הסלולר אירועים נורמליים במחלות ניווניות נחקרו9,10,11,12,13,14. למרות tdp-43 הוא חלבון גרעיני15, יש לו את היכולת הסעה פנימה והחוצה בין הגרעין והציטופלסמה בשל נוכחותם של לוקליזציה גרעינית ורצפים ייצוא גרעיני16,17,18,19. Cytoplasmic TDP-43 מעורב באירועים סלולריים שונים, כגון היציבות mRNA והתחבורה, תגובת הלחץ, פונקציה מיטוכונדריאלי, המשך באופן אוטומטי כמה20. עם זאת, לא הרבה ידוע על התפקיד של נגזרות זרחני של TDP-43 מלבד המעורבות שלהם בפתוגנזה של מחלה ניווניות21.

פרוטוקול זה ממחיש כיצד לייעל את תנאי הגישה כדי לנתח את התוכן של TDP-43 ואת נגזרת זרחתיה שלה בטסיות באמצעות הגישה CEI. מאז זרחני TDP-43 אינו זמין מסחרית, הוא מוצע להשתמש בערך זרחון חזוי (PPV) כדי להעריך את הפרופילים של TDP-43 בחולים ALS. מערכת CEI זו מנצלת נפח קטן של תערובת לדוגמה (2.5 – 3.0 μL לכל נימי דם). הגדרת עוצמת הקול הכוללת של שיטת האחסון היא 8.0 μL לכל קפילר בהתבסס על פרוטוקול היצרן; מכאן, החוקרים יכולים להשתמש אחד לדוגמה תערובת הכנה לשני מסלולים נפרדים. היצרן עיצב את פרוטוקול הספק כך שכל שגיאות הליטוף יהיו מזעריות, אם לא יבוטלו לחלוטין. The 24 האדם בודדים טסיות לדוגמה תערובות מחולקים לחצי כרכים (כלומר, 2.5 – 3.0 μL לכל מדגם) ו ניתח ברציפות אלה על ידי שני נוגדנים שונים בתוך ~ 7 h. מערכת ה-CEI המתוארת כאן מספקת מודאליות רצויה של תפוקה גבוהה. משתמשים צריכים לבדוק נוגדנים מספקים שונים ושיטות הכנה לדוגמה עבור חלבון היעד לפני ביצוע הקרנה בקנה מידה גדול.

Protocol

כל הפרוטוקולים בנוגע לעיבוד של טסיות האדם לעקוב אחר ההנחיות של המרכז הרפואי של אוניברסיטת קנזס ובאוניברסיטת קנזס סיטי לרפואה וועדות ביוטכנולוגיה IRB. 1. הכנת מאגרים וריאגנטים הערה: הכן את כל הדגימות לפי הנחיות היצרן. לבשו ציוד הגנה אישי (מעילים, כפפות ומשקפי מגן) במהלך הליך זה. הכנת מאגר שטיפת ציטראט על ידי שילוב 0.941 g של סוכרוז (הריכוז הסופי של 11 מ”מ), 6.4 mL של 5 M הנרוג (128 מ”מ הסופי), 5.4 mL של 0.2 Mהשניפו4 (4.3 מ”מ הסופי), 9.4 Ml של 0.2 m Na2PHO4 (7.5 מ”מ הסופי), 0.352 g של נתרן ציטראט (4.8 מ”מ הסופי), ו-1 g של חומצת לימון (0.115 מ”מ הסופי). כוונן את הנפח הכולל ל-250 mL עם ddh2O. מסנן דרך דיסק מסנן 0.45 יקרומטר ולהתאים את ה-pH ל 6.5. אחסן עד שנה אחת ב -4 ° c. הביאו את טמפרטורת חדר הפתרון (RT) לפני השימוש ב-22. הכינו את מאגר הקרע על-ידי שילוב 250 מילימטר, 1 מ”מ EDTA, ו 10 מ”מ טריס-Cl (pH 7.4) בנפח הסופי ב100 mL. אחסן עד שנה אחת ב -4 ° c. הוסף 2 μL של מעכבי הקוקטייל פוספספטאז (1:1000 הסופי) ו-1 μL של מעכבי להפרוטאז קוקטייל (1:2000 הסופי) לתוך 2 מ ל של מאגר הקרע. . שמור על הקרח עד השימוש בטל את מאגר הקרע שאינו בשימוש. 2. בידוד טסיות לאסוף 8 – 10 מ ל של דם האדם בתוך שפופרת אוסף דם צהוב-כיפה המכילים חומצה ציטראט-דקסטרוז (ACD) פתרון (75 mM trisodium ציטראט, 124 mM דקסטרוז, ו 38 לימון מ”מ, pH = 7.4; ACD: דם = 1:9). מערבבים בעדינות את תוכן הצינור 5x – 6x היפוך ביד. צנטריפוגה את הצינורות ב 200 x g ברוטור דלי מנופף עבור 20 דקות ב RT. איסוף פלזמה עשיר טסיות (PRP) (~ 3 – 4 mL) לתוך שפופרת 15 mL בתחתית חרוט ולהשאיר כ 0.5 mL של PRP מן המעיל באפי (שבר מעורפל מראה) כדי למנוע זיהום. אם מתרחש זיהום של תא דם אדום, חזור על שלב זה. צנטריפוגה את דגימות PRP ב 1,200 x g עבור 15 דקות ב RT. לשטוף את כדורי טסיות (P1) על ידי השעיית מחדש עדין ב 1 מ ל של מאגר לשטוף ציטראט ואת הגלולה על ידי צנטריפוגה ב 1,200 x g עבור 15 דקות ב RT. . שמור את הגלולה הטהורה . מחק את הסופרנטאנט השהה מחדש את כדורי הטסיות ב-600 μL של מאגר הקרע המכיל קוקטיילים מעכבי. Sonicate את ההשעיה של טסיות באמצעות sonicator. מניחים את המדגם בדלי מיני קרח. הגדר את הsonicator בהגדרה 3 עבור 20 s במצב רציף.הערה: הקפד לנקות את המקדח עם 10% אקונומיקה ואחריו מים מזוקקים. צנטריפוגה את דגימות sonicated ב 20,000 x g עבור 30 דקות ב 4 ° צ’ כדי להסיר שברים קרומי. מחלקים סופר-שנים ב-60 μL ומאחסנים ב-80 ° c. הימנע מחזורי החלקה/הקפאה של שברים של טסיות דם. 3. הכנה לקראת CEI הערה: 100 μL של טסיות דם האדם היה משולב מחולים ALS (n = 8-10), ונושאים בריאים (n = 8-10) היו בנפרד במאגר ומשמש למיטוב השימוש. מלא תבניות שנוצרו בתוך הבית עבור פריסת CEI (טבלה 1) והכנה לדוגמה (טבלה 2). טבלת ההכנה לדוגמה היא דינאמית ויחשב באופן אוטומטי את כמות הנפח הדרושה להסרה מהמקור.הערה: כאשר אמצעי האחסון הנדרש של המקור המוזן בטבלה הדינאמית 2, 0.1 מחושב באופן אוטומטי על-ידי אמצעי אחסון של מאגר לדוגמה. טרום התווית 25 0.2 מ”ל צינורות PCR עם נימים #1 – #25 ולמקם אותם במדף ה-PCR. . מוכן לקרח טרום התווית 0.6 mL מיקרוצנטריפוגה צינורות: אחד עבור כל נוגדן הראשי דילול (אם יש צורך) לשמש, אחד עבור 0.1 x מאגר לדוגמה, אחד עבור הלומירול-S/תחמוצת, ואחד עבור כל מדגם להיות מדולל (אם יש צורך). . שים אותם על קרח במתלה הצינורות להוציא את המאגר לדוגמה, לשטוף את החוצץ, צלחת אחת, ומחסנית שסופקו בהפרדה CEI 12 – 230 ערכת מאסטר kDa ההפרדה מודול. מתוך 4 מקרר ° c, להוציא את מאגר דילול נוגדן, נוגדנים עיקריים, נוגדנים משניים, לומינול, חמצן מימן, וחבילת סטנדרטי. מניחים את כל הריאגנטים על הקרח, מלבד חבילת סטנדרטי, אשר נשאר בשעה RT.הערה: הריאגנטים מהאריזות הסטנדרטיות מנוכל וחתום בנייר עטיפה. אלה צריכים להיות מסובב בקצרה באמצעות צנטריפוגה מיני לפני הפתיחה כדי להפחית את אובדן המוצר. כדי לפתוח, ניתן לנקב את הצינורות האגריטים על-ידי עצת פיפטה או לסגת מהפינה. כדי להכין את 400 mM DTT, להוסיף 40 μL של מים מוכי לצינור ברור המכיל את DTT. כדי להכין 40 μL של מיקס מאסטר 5x פלורסנט, להוסיף 20 μL של מאגר לדוגמה 10x ו 20 μL של הפתרון המוכן 400 mM DTT לצינור הוורוד המסופק בערכה. כדי להכין את הסולם biotinylated, להוסיף 16 μL של מים מיוהים, 2 μL של מאגר לדוגמה 10x, ו 2 μL של הפתרון 400 mM מוכן DTT לצינור הלבן שסופקו בערכה. מערבבים בעדינות ומעבירים לצינור 0.2 mL ל-PCR. הכינו 0.1 x מאגר לדוגמה על-ידי הוספת 1.5 μL של מאגר לדוגמה 10x ו 148.5 μL של מים מפוהים לצינור מיקרו-צנטריפוגה 0.6 mL. . מערבולת לערבב ולשים בקרח הכינו את מדלל הנוגדנים הרצויים. הוסף נוגדן מדלל באמצעי אחסון המיועדים לכל שפופרת מיקרו צנטריפוגה שכותרתו מראש. אם אמצעי האחסון זהים, השתמשו בטכניקת היפוך23; אם לא, לשטוף מראש את העצה הפיפטה לפני החילוק.הערה: בתוך מעשה זה, a-TDP-43 הנוגדן פאן ו-p (S409/410-2) TDP-43 הנוגדן שימשו. נוגדנים נגד טיפשה שימשו לשליטה פנימית כדי לוודא שרכיבי הספק עובדים. בצע ליטוף הפוך לדילול נוגדנים כמתואר להלן. לחילופין, ניתן למצוא מידע נוסף בספרות24.הערה: שיטת הפוך ליטוף היא המועדפת כאשר מחלק אמצעי אחסון רציפים קטנים של פתרונות23. טכניקה זו מציעה מספר יתרונות: (i) מתן נפח מדויק, (ii) ביטול קצף מגיב בחור הקצה, ו (iii) אידיאלי עבור נפח קטן (< 5 μL) ריאגנטים, פתרונות צמיגה, פתרונות מפעילי ופתרונות עם לחץ אדי גבוה. שים טיפ מתאים בפיפטה ולחץ על הבוכנה עד לתחנה השנייה (שלב -2). לטבול את הטיפ pipet כמה מילימטרים לתוך הפתרון. לאט לשחרר את הבוכנה כדי למלא את הטיפ pipet עם הפתרון בעוד הטיפ הוא עדיין שקוע בפתרון. הסר את העצה מהפתרון והגע בעדינות מול הקצה של מאגר התמיסה, כך שהנוזלים העודפים שנותרו בצד החיצוני של הקצה יוסר. מוותר על הפתרון על-ידי לחיצה על הבוכנה עד לעצירה הראשונה (שלב -1). אין לוותר על הפתרון הנותר בקצה. רוקן את הפתרון הנותר בעצה למאגר האגריגיב על-ידי לחיצה על הבוכנה לעצירה השניה (שלב -2). שחררו את הבוכנה למיקום המוכן לשלב הבא. הוסף את הנוגדן הנדרש באמצעי אחסון המיועדים לכל שפופרת מיקרוצנטריפוגה מראש (שולחן 1) לא לשטוף מראש את הטיפ pipet: להוסיף אותו ישירות לדילול ולשטוף את הטיפ פעמים מרובות כדי להסיר נוגדנים. . הניחו את הצינורות על הקרח כדי להכין את מיקס הדגם CEI, בצע את השלבים המפורטים להלן עבור צינורות ה-PCR המסומנים cap 2 עד cap 25: זה באותו סדר כפי שהוא מופיע בטבלה 1. פתח את כל הצינורות, להוסיף 1.6 μL ali, מאגר לדוגמה של פלורסנט 5x לכל צינור באמצעות טכניקת היפוך ליטוף, ואז לסגור כל צינור PCR על התוספת של מאגר 5x כדי למזער את ההפסד לדוגמה. פתח את כל הצינורות, להוסיף 0.1 x מאגר לדוגמה באמצעי אחסון המיועדים בטבלה 2 לכל צינור, ולאחר מכן לסגור מיד לאחר מכן. אם אמצעי האחסון זהים, השתמש בטכניקת היפוך ליטוף. אם לא, שטוף לפני לשטוף את הטיפ לפני החילוק 0.1 x מאגר לדוגמה. פתח את כל הצינורות, להוסיף דגימת חלבון באמצעי אחסון המיועדים בטבלה 2 לכל צינור, ולאחר מכן לסגור מיד לאחר מכן. אם אמצעי האחסון זהים, השתמשו בטכניקת היפוך ליטוף. אם לא, שטוף לפני לשטוף את הטיפ לפני החילוק 0.1 x מאגר לדוגמה. בקצרה צנטריפוגה את כל צינורות ה-PCR ב צנטריפוגה שחקן ספסל (13,000 x g עבור 30 s), קפיצי/מערבולת PCR צינורות לערבב, ואז לחזור על צנטריפוגה. להעביר את כל צינורות ה-PCR לתוך הציקלוניים עם מכסה מחומם. הספרות בטמפרטורה ומשך מוגדר (כלומר, 95 ° צ’ במשך 5 דקות; 70 ° צ’ במשך 10 דקות).הערה: הטמפרטורה והמשך הדנטורציה צריכים להיות ממוטבים לחלבון היעד. חזור על שלב ה3.12.4. החזר את כל צינורות ה-PCR למתלה השפופרת והניחו על הקרח. במהלך הצעד המהלך, להכין את פתרון הפיתוח (1:1 לומינול-S:peroxide הפתרון), ואז להוסיף 200 μL של לומייול-S ו 200 μL של תחמוצת. . מקום על הקרח כדי לטעון את הצלחת מראש CEI עם המדגם הכין לעיל, לוותר ריאגנטים ודגימות לתוך צלחת המילוי המוצג בפריסת השיטת (איור 1). להימנע מציג בועות אוויר.הערה: אם אמצעי אחסון ופתרונות זהים, השתמש בטכניקת היפוך ליטוף. אם לא, לשטוף מראש את העצה לפני החילוק ולא לגרש את השארית לתוך הצלחת באמצעות עצירת הטאב השני על הפיפטה. מודול הפרדה של 12 עד 230 מקדא עשוי להכיל מדריך לטעינת צלחות מקודד בצבע. הציבו מדריך זה תחת הצלחת תוך הוספת ריאגנטים ודגימות לבאר, אשר מסייע חזותית כאשר הטעינה לדוגמה. ניתן להוריד את מדריך טעינת הצלחות גם מאתר החברה. בשורה E, להוסיף 15 μL של הלומינול: תערובת חמצן לכל טוב.הערה: באופן אידיאלי, הכן מגיב זה רק לפני השימוש והוסף לכל באר. אם זה לא נוח, תערובת זו עשויה להיות מוכנה לא יותר 30 דקות לפני טעינת צלחת. בשורה D, כדי לבאר D1, להוסיף 10 μL של streptavidin-HRP. בשורה D, כדי בארות D2 – D25, להוסיף 10 μL של נוגדן משני ייעודי. בשורה ב’, לכל באר, להוסיף 10 μL של נוגדן מדלל. בשורה C, כדי היטב C1, להוסיף 10 μL של נוגדן מדלל. בשורה C, כדי בארות C2 – C25, להוסיף 10 μL של הנוגדן העיקרי המיועד. בשורה A, כדי גם A1, להוסיף 5 μL של סולם ביולוגי מתוך שפופרת ה-PCR #1. בשורה A, כדי בארות A2 – A25, להוסיף 3 μL של המדגם, צינורות PCR #2 – #25 לתוך בארות המקביל #2 – #25. הוסף 500 μL של מאגר כביסה לכל מאגר כביסה מיועד היטב. צנטריפוגה את הצלחת עבור 5 דקות ב 1,000 x g ב RT. איור 1: פריסת שיטת העיצוב. שני נוגדנים עיקריים ואופטימיזציה לדוגמה חלבון היעד ניתן לבצע באחד השיקול. נימים 2 – 7, 8 – 13, 14 – 19, ו 20 – 24 מייצגים ריכוז חלבון שונים טווח הנוגדן העיקרי. . קפילר 25 מייצג שליטה חיובית השתמשו בנוגדן נגד טיפשה; עם זאת, ניתן לכלול כל פקד חיובי מתאים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. 4. ביצוע CEI על צלחת 1 תחילה, הפעל את מנתח CEI (רשימת החומרים) ולאחר מכן הפעל את המחשב. פתח את התוכנה (רשימת חומרים) חבר את המנתח למערכת המקוונת (טבלת חומרים). זהו צעד הכרחי כדי לאסוף את הנתונים לפעול לבעיות ירי למטרות ושחזור נתונים. לחץ על כלי מהתפריט השמאלי העליון, ולאחר מכן לחץ על התחבר. בחר במספר הסידורי של הכלי שמופיע כתפריט נפתח. לחץ על התחבר. בחר את הכרטיסייה “שיטתהמילה” ובחר באפשרות ‘ שיטת ‘ החדשה או בחר תבנית שנשמרה. פרמטרי שיטת קלט (טבלה 1) או שינוי תבנית כרגע. שמור את שם הקובץ והמיקום. ודא שמחוון הצבע הכחול המהבהב במנתח נשאר כחול מוצק. לגעת בכפתור מתכת כסף על גבי הדלת הכתומה לפתוח. הסר בזהירות את מחסנית הקפילר מאריזתו. הכנס את מחסנית הקפילר כפי שמתואר בפרוטוקול היצרן. אם הותקנה כראוי, האור הפנימי יהפוך ל-“blue”. הסר את החותם המגן מלוחית השיטת האבטחה. להתבונן באופן חזותי את הבארות שמולאו מראש עבור בועות אוויר. אם נצפתה, פופ אותם עם טיפ קטן pipet (ארוך פיר P10 pipet טיפ עובד היטב). העמיסו את מחזיק הצלחת על ידי הצבת צלחת החדר וסגור את הדלת. במחשב, לחץ על כפתור התחל . מניחים מגש קרח המכיל ריאגנטים רגישות לטמפרטורה ודגימות בחושך על 4 ° c עד מוכן להכין צלחת שנייה מלאה. השאירו ריאגנטים/אספקה החוצה בטמפרטורת החדר לצלחת השנייה. 5. ביצוע CEI על צלחת 2 הערה: צלחת זו מוגדרת לניתוח של TDP זרחני-43 רמות. הסר את מגש הקרח המאוחסן ב 4 ° צ’ ומניחים אותו על הספסל, 1 h לפני זמן ההשלמה המשוער של הצלחת הראשונה. אחזר צלחת נוספת ומחסנית. הכינו כל מדלל נוגדן הדרושים להפעלה השנייה ואחסן אותם על הקרח. הכינו טרי 1:1 לומייול-S:peroxide תמיסה (שלב 3.12.8 לעיל). Remix ו לזמן קצר מחדש צנטריפוגה את התמהיל לדוגמה ריאגנטים הדרושים לטעינת צלחת מלאה מראש. טען את הלוח השני בהתאם לאיור 1. טען a-p (S409-410-2) TDP-43 הנוגדן פתרון ב שורה C בארות. לאחר השלמת ההפעלה הראשונה, מחק את הצלחת הראשונה ואת המחסנית. הסר את מיכל הדיו והציבו את המיכל החד לסילוק. שמור את המדבקות מלוחית ומחסנית למטרות ייחוס. סגור את קובץ התוכנה ובנה מבחור את אותה תבנית. התוכנה תזכור את ההגדרות מתוך ההפעלה הקודמת. בצע שינויים בביאור לפי הצורך (כלומר, שינוי הנוגדן העיקרי). חזור על שלבים 4.8 – 4.10. לשים את כל 12-230 מאסטר kDa ערכת ההפרדה ריאגנטים ואספקה למחוק שמאל על CEI לדוגמה-mix, מדלל נוגדנים, 0.1 x מאגר לדוגמה ו-לומייול-S:peroxide תערבב בהתאם לתקנות האוניברסיטה. 6. ניתוח נתונים לאחר השלמת ההפעלה, ודא שבדיקות האיכות הבאות מתבצעות. בתוכנה, בחר את הכרטיסיה הצג סמל תקנים ותצוגת גרף . בדוק את כל 25 הנימים עבור מערכים השיא לגדלי פלורסנט פנימיים. תקן את הערכים השגויים על-ידי בחירה באפשרות כפה רגילה או לחיצה ימנית על הפסגה השגויה ולאחר מכן בחירה באפשרות לא סטנדרטית. בצע בדיקה זו עבור כל נימי חדש. לחץ על דגימות והסמל ‘ תצוגה בודדת ‘. בחר #1 קפילר (סולם ביולוגי) בכרטיסיה ניסוי. סקור את מערכים השיא לסמני משקל מולקולרי. לחצו על הפסגה בתצוגת גרף ובחרו ‘ הסר שיא’, אם בחירה שגויה של השיא נעשית על-ידי התוכנה.הערה: לדוגמה, הסולם הביו-ממדי של 12 עד 230 מראה את פסגות הגודל ב-12 kDa, 40 kDa, 66 kDa, 116 kDa, 180 kDa, ו-230 kDa. גודל הפסגות לדוגמה יהיה שגוי אם שלב זה לא יבוצע וייצור תוצאות לא מדויקות. הצג את הסרט אלקטרולפיטי והלב אם העברה חריגה אירעה במהלך ההפעלה. גזור נתונים (למשל, שולחן פסגות, כולל משקל מולקולרי, אזור שיא, גובה שיא, אות לרעש [S/N]) לפי הצורך לחישובים נוספים. ישנם כלים לביאור גרף הממוקמים בפינה הימנית העליונה של חלון הגרף לצורך מתן מידע נוסף אודות הגרף.

Representative Results

אופטימיזציה של ריכוז החלבון cytosolic של טסיות ונוגדן העיקרי טיטורחשוב להקים טווח דינמי ליניארי של חלבונים ציטוסולטליים בתוך הסדר, מאז שינויים באות הם יחסיים ישירות שינויים בחלבון ציטוזול טסיות. שימוש בתערובת טסיות ליפוסט שלמה בתוך ה, עשוי להפחית את עוצמת האות של חלבונים היעד (TDP-43 ו P (S409-412) TDP-43) ולתרום לאות ברקע גבוה. לכן, באותו מקרה, שימש הסופרנטאנט הברור (שבר ציטוסולג) לאחר טסיות דם (איור 2). איור 2: בהירות האות תלויה באיכות המדגם. (A) שלמות טסיות ליפוסטהומוטה מפריעה עם ANTI-tdp-43 נוגדן כריכת; לפיכך, מומלץ לצפות באלקטרופגרמה רועשת. (ב) שבריר של טסיות דם ציטוזה התקבל מתוך הצנטריפוגה את כל הליפוסט למטה (16,000 x g עבור 30 דקות). רוב החלבונים הקרומי הוסרו; מכאן, anti-TDP-43 נוגדן הכריכה כדי TDP-43 חלבון היה משופר (מעקב קו כחול). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. טווח דינמי ליניארי עבור ריכוז חלבון ציטוקי טסיות הוקמה בשנת 0.2 – 0.8 mg/mL. תבנית של שיטת הפעולה אומצה כך שריכוז החלבונים והנוגדן העיקרי הצליחו להתבצע באותו מבחן (איור 3). איור 3: טווח דינמי ליניארי לריכוז החלבון הציטומי טסיות. (א) גם ריכוזי החלבון והנוגדנים בנוגדן היו ממוטבים בצלחת אחת במהלך אותה הפעלה. (ב) טווח עבודה ליניארי (0.2 – 0.8 מ”ג/mL) עבור חלבון הוקמה. לטעון חלבון 0.5 mg/mL היה מתויג על ידי נוגדן בתור שליטה חיובית (קפילר 25). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. יצוין כי תוכן גליצרול בצינור ההכנה לדוגמה צריך להיות פחות מ -20% (הסופי), אחרת ריכוז גלירול גבוה יהיה להשפיע לרעה על כריכת הנוגדן העיקרי. קביעת זמן חשיפה אופטימליבגירסה הישנה יותר של התוכנה, זמן החשיפה האופטימלי היה צריך להיקבע על ידי התוויית אזור שיא נגד ריכוז חלבון (mg/mL). הגירסה החדשה מספקת כלי חדש בשם פרופיל הזיהוי של טווח דינמי גבוה (HDR) (איור 4). באמצעות הפאנל התמונה סיפק את האפשרות להציג את כל זמני חשיפה (כלומר, 5 s, 15 s, 30 s, 60 s, 120 s, 240 s, 480 s) יחד. תוכנת מחשב ניתח את כל זמני החשיפה וזיהה אוטומטית את זמן החשיפה הטוב ביותר (HDR). פרופיל זיהוי HDR נמסר טווח דינמי רחב באופן משמעותי עקב רגישות גבוהה יותר של CEI, כלומר יותר איתור וכימות מעל טווח ריכוז גדול יותר לדוגמה. עם זאת, למשתמשים עדיין יש את האפשרות לבחור כל זמן חשיפה העונה על המטרה הניסיונית. באמצעות תכונה זו, זמן חשיפה מיטבי נמצא עבור TDP-43 חלבון. השיא מייצג את זמן החשיפה האופטימלי (איור 4א). זמן חשיפה אחת (4 s) הוגדרה עבור נוגדן זה לאחר סקירת כל תשע פעמים חשיפה הנע בין 1 – 512 s (איור 4ב). איור 4: פרופיל זיהוי טווח דינמי גבוה (HDR) עבור חלבון יעד. (א) tdp-43 השיא חלבון מייצג את זמן החשיפה האופטימלי עבור חלבון היעד. a-TDP-43 Ab טיטור היה 1:300, ואת הריכוז החלבון ציטוזול חלבונים היה 0.5 mg/mL. הקו הכחול המוגדר על-ידי התוכנה מציין את זמן החשיפה האופטימלי. (ב) איור זה מייצג זמן חשיפה יחיד המוגדר על-ידי המשתמש (4 s) לאחר סקירת כל תשע זמני החשיפה הנע בין 1 – 512. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. TDP-43 רמות בציטוסול טסיות האדם של מטופלים ALSהתפתחות בדיקת דם. בסיסית בוצעה באמצעות תנאי שימוש ממוטבים, שברים טסיות דם ליפוסט מושגת מחולים ALS נותחו באמצעות שני סטים של נוגדנים (כלומר, anti-TDP-43 [פאן] נוגדן, נוגדן המכיר נגזרות זרחנים של TDP-43 חלבון; כאן, a-P [S409/410-2] TDP-43 היה בשימוש). בהפגנה זו, TDP ספציפי למחלות-43 ו נגזרת זרחתיה שלה מוצגים (איור 5). איור 5: ייצוג של ערך זירחון חזוי (PPV) של TDP-43. הכמות המוחלטת של TDP זרחני-43 ופאן TDP-43 לבדו לא הראה הבדל רב בין ה-ALS לבין קבוצות בקרה. עם זאת, PPV הצביע על עלייה קלה הקבוצה של ALS, למרות שלא היה הבדל סטטיסטי בין שתי הקבוצות עקב מספר מספיק של נושאים (ALS = 25, שליטה = 27). ערך d של כהן נמוך בין האמצעי של ALS וקבוצת בקרה הראה גודל השפעה נמוכה בין שתי הקבוצות בשל גודל מדגם קטן (בקרה = 25, ALS = 27). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. סך TDP-43 היה כימות באמצעות עקומת הכיול (איור 6) איור 6: עקומת כיול סטנדרטית. רקומביננטי TDP שנרכשו מסחרית-43, ריכוזי חלבון שימשו כדי לבנות עיקול רגיל. כל אחד מהנתונים מייצג את הממוצע של מטריפליטים. עוצמות הכוונות של החלבון היו תלויות בריכוז (שיבוץ). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. הקוונפיקציה של TDP זרחתית-43 חלבון לא היה אפשרי עקב חוסר זמינות מסחרית של חלבון זה. במקום זאת, ערך זירחון חזוי (PPV) הוקם המגדיר את אחוז מינים זרחניים של TDP-43. PPV נקבע משני מסכים רציפים לדוגמה באמצעות המשוואה הבאה. שינויים בשיטת הניהול הפנים-פנימית נבדקו בתוך שברים של טסיות דם אנושיים (איור 7) איור 7: וריאציות של שינויים. (א) שני נימים טעונים באותה דוגמית נותחו על ידי cei, וריאציה של שיטת הפעלה פנימית חושבה כ-CV% = 14.9. (ב) מדגם זהה נותח בשלושה ימי שינוי שונים ובשלוש מריצות שונות. וריאציה של שיטת ההפעלה הבין-הפעלה חושבה כ-CV% = 18.7. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. למרות שערכים וריאציות של מקדם הפעלה (CV-to-נימי) מקדמי של ערכי וריאציה נפלו בטווח המקובל (14.9% =), ערך השיטת הניהול הבין-מופעל היה גבוה יחסית (CV% = 18.7). מפורש כי וריאציה זו עשויה להיות עקב שימוש במחסניות קפילר ולדוגמה צלחות מהמון שונים. מומלץ לבצע מחקרים הניתנים לביצוע ברכיבי CEI בעלי מספר מאוד זהה. טבלה 1: שיטת הטעינה של לוח הבסיס של cei. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הטבלה. טבלה 2: תבנית אינטראקטיבית להכנת תערובת לדוגמה. לאחר הזנת הריכוז חלבון מניות מדגימות לא ידועות, תאים אינטראקטיביים יחשב באופן אוטומטי כמה נפח צריך לשמש להכנת מיקס לדוגמה. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הטבלה.

Discussion

מערכת החיסונית המבוססת על נימי הנימים היא כיום שיטת הבחירה לניתוח מדגם בתפוקה גבוהה והקרנות התרופות25. כרכים קטנים לדוגמה, רכיבי שיטת מיטוב היטב, פלטפורמת שיטת האחסון והמכשור הידידותיים למשתמש, הוצאות מגיב ואחוזי הפחתת קורות חיים נמוכים הם היתרונות העיקריים26,27. למרות שישנן מספר שיטות להפרדת חלבונים בשיטות שונות ומבוססות, הנוגדן שמתואר כאן יכול להיות מותאם על ידי מעבדות קטנות העוסקות בפיתוח ביונסיקר מבוסס דם. הטכנולוגיה של השימוש ב-CEI המשמשת כאן מספקת אמינות, מדידות ורגישות עבור TDP-4328 והנגזרת הזרחנות שלה5.

מערכת CEI מספק גם מבחר ריבוב של ניתוח TDP-43 ונגזרות זרחנות שלה בו זמנית ולספק את הקוונפיקציה ישירה של חלבון היעד, אם מטוהרים או רקומביננטי היעד חלבון זמין. באורך מלא רקומביננטי TDP-43 חלבון הוא זמין מסחרית; עם זאת, רקומביננטי זרחני TDP-43 נגזרות לא. מאז זרחני TDP-43 אינו זמין מסחרית, ערך זרחון חזוי (PPV) יושם כדי להעריך TDP-43 פרופיל בחולים ALS. פאן TDP-43 ו-TDP זרחני-43 כמויות היו מתויג לצמיתות עם פלואורואופפור; לכן, פרופיל TDP-43 נשאר זהה עם או בלי יחידה כמותית (כלומר, ng/mL, pg/mL, וכו ‘). למרות קביעת כמות מוחלטת של TDP-43 ונגזרות זרחנים שלה (כלומר, P [S409-410-12] TDP-43) מספק מדידה כמותית יותר, חישוב PPV מבטלת את הצורך של רקומביננטי זרחנים TDP-43 עבור סטנדרטיזציה, מאז הוא לא זמין מסחרית.

CEI מספק מספר מחסומים בפלטפורמת הספק כדי לזהות במדויק את הבעיה במקרה שהתקלה נכשלת. זה מבטל את המכשולים ומספק עיצוב ניסיוני טוב יותר. תהליך הטיפול הוא אוטומטי לחלוטין, למעט מילוי צלחת המדגם. זוהי תכונה משמעותית בהשוואה לניתוח הכתמים המערביים הסטנדרטיים. תכונה זו מספקת עקביות מהפעלה-להפעלה. למרות שכל מעבדה כוללת נוהלי הפעלה סטנדרטיים ייחודיים, חשוב לדבוק בשיטות המזגרות את הטעות האנושית. לדוגמה, זה קריטי להכין את לומינול-S/תחמוצת התערובת רק לפני טעינת הצלחת, מאז הוספת חמצן לתוך הלומינול מתחיל את התגובה אנזימטית וצורכת המצע הלומינול. טעינת דגימות ונוגדנים ראשוניים/משניים לבארות צלחת ללא בועות אוויר הם גם צעדים חשובים באופן ביקורתי.

בנוסף, מאז בארות הצלחת הם קטנים בנפח ואין מקום בין בארות, משתמשים צריכים לנקוט זהירות בעת ליטוף, שהוא הצעד החשוב ביותר מאז כל דבר אחר הוא אוטומטי. מסדר ההעמסה של הדגימות, הנוגדנים והריאגנטים האחרים חשוב לעקביות של השיטת (איור 1). תהליך הכנת הצלחות לוקח בערך 40 – 45 דקות. לכן, מומלץ לטעון תחילה את הצלחת עם רכיבי השיטה הנדרשים ולהכין את תערובת הלומינול-S/מי חמצן ממש לפני הליטוף. בדרך זו, יש רצף עקבי של הוספת מגיב, ועוצמת אות עקבית באופן עקבי תהיה מושגת. לא מומלץ להשתמש הלומירול שפג תוקפם/חמצן מגיב, כפי שהוא משפיע בעיקר על חוזק של מי חמצן. ההתקדמות האחרונה בהצגת מערכת פיצול מאגר וכולל טווח תאימות כימיים וחומרי ניקוי הגדילו את איכות הרשת והפיקה תוצאות מתועלות וצפויות יותר. עכשיו, מנתח משולבת חדש מאותו היצרן בעל תכונה לניתוח דגימות המסומנות עם כימואומיננסנציה ו-מעלה נוגדנים מצופני קרינה באותו לרוץ. תכונה חדשה זו מבטלת את הצורך להפעיל ברציפות שתי צלחות בודדות ומבטלת את ההפעלה הפעלה-to-הפעלה.

יש לאחסן את לוחיות השיטת האחסון בטמפרטורת הסביבה. אם הוא נבחר לשמור את לוחיות הזמן במקרר של 4 ° c, יש להוציא את הלוחות בלילה שלפני המנה ולהביא לטמפרטורת הסביבה. בארות לדוגמה טעון באופן שגוי צריך להיות בהרחבה (4 – 5 פעמים) שטף עם המאגר סיפק בערכה לפני הוספת המדגם הנכון. כל נוגדן ראשוני ודגימות ביולוגיות הן ייחודיות; לכן, אופטימיזציה נוגדן/חלבון צריך להתבצע לפני ניתוח דגימות עבור חלבונים היעד בנוזלים ביולוגיים.

כאן, הזמן דגירה הנוגדן העיקרי נקבע 30 דקות כברירת מחדל. אם האות הוא חלש, משתמשים צריכים לשקול להגדיל את זמן דגירה העיקרי נוגדן עד להגיע כוח האות הרצוי ללא שחיקה האות הפלואורסצנטית. עבור טסיות האדם, דגימות במאגר מהחולים היו מוכנים משמש לצורך שיטת אופטימיזציה. הצירוף לדוגמה מייצג טוב יותר את הווריאציה בין biomolecules היעד. מומלץ להשתמש supernatants ברור במקום ליפוסט מוחלט או כולל הומואט עבור CEI.

הריכוז הגבוה של החלבון בתערובת של טסיות דם מלאה עלול להקטין את היחס בין האות לרעש (איור 2). הקפאת מחזורי ההפשרה של דגימות יש להימנע, כמו זה משפיע לרעה על כריכת נוגדנים העיקרי. המרכיבים של מאגר ליפוסט הם חשובים, כמו כמה ריאגנטים אינם תואמים CEI29. מומלץ להצליב את רשימת הריאגנטים התואם באתר האינטרנט של היצרן לפני ההכנה לדוגמה. זוהי הגבלה של המערכת שאינה סובלת תנאים מאוד גבוהים להכנה לדוגמא. מומלץ למטב את הפרמטרים של הפעלת השיטה (כלומר, דילול נוגדן ראשוני, ריכוז חלבונים, זמן הדגירה העיקרי של הנוגדן, וכו ‘) באמצעות דגימות במאגר כדי לנתח לאחר מכן את דגימות בודדות.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

מחקר זה בחסות מענק פנימי. שהוענק לאלכוהוליסטים אנונימיים עבודה זו נתמכת על ידי מענק CTSA מ NCATS הוענק למרכז הרפואי של אוניברסיטת קנזס לגבולות: מכון לבלב למחקר קליני וטרנסלtional (#UL1TR606381). התכנים הם באחריותם הבלעדית של המחברים ואינם מייצגים בהכרח את ההשקפות הרשמיות של NIH או NCATS. אנחנו אסירי תודה על אוניברסיטת קנזס מרכז רפואי מרפאת ALS אישי לקבלת אישור IRB לדגימת דם אוסף מחולים בריאים מתנדבים ALS. המחברים מודים Emre Agbas על הגהה של כתב היד.

Materials

12-230 kDa Separation kit ProteinSimple SM-W004 Contains pre-filled assay plate and 25-channel capillary cartridge
3000G Thermocycler Techne FTC3G/02 We used this thermocylcer for heating the sample mix
Anti-Mouse detection kit ProteinSimple 042-205 Includes HRP-conjugated secondary antibody, buffer, luminol reagent, molecular weight marker
Anti-P(S409-410) TDP-43 antibody ProteinTech 22309-1-AP Primary antibody that recognizes phosphorylated TDP-43
Anti-P(S409-412) TDP-43 antibody CosmoBio-USA TIP-PTD-P02 Primary antibody that recognizes phosphorylated TDP-43
Anti-Rabbit detection kit ProteinSimple DM-001 Includes HRP-conjugated secondary antibody, buffer, luminol reagent, molecular weight marker
Anti-TDP-43 (pan) antibody ProteinTech 10782-2-AP Primary antibody that recognizes whole TDP-43 protein
Compass for SimpleWestern (SW) ProteinSimple Ver.4.0.0. Compass for SW is the control and data analysis application for SimpleWestern instruments
Sonic Dismembrator; Model100 Fisher Scientific Sonicator. Used to rupture the cell membrane. This model is discontinued (Model XL2000-350)
Table top centrifuge Eppendorf 22625004 Model# 5810 with swinging plate bucket
Wes analyzer ProteinSimple 55892-WS-2203 Performs the capillary gel electrophoresis
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Blair, P., Flaumenhaft, R. Platelet alpha-granules: basic biology and clinical correlates. Blood Reviews. 23 (4), 177-189 (2009).
  2. Mercado, C. P., Kilic, F. Molecular mechanisms of SERT in platelets: regulation of plasma serotonin levels. Molecular Interventions. 10 (4), 231-241 (2010).
  3. Goubau, C., et al. Regulated granule trafficking in platelets and neurons: a common molecular machinery. European Journal of Paediatric Neurology. 17 (2), 117-125 (2013).
  4. Basu, S. S., et al. Human platelets as a platform to monitor metabolic biomarkers using stable isotopes and LC-MS. Bioanalysis. 5 (24), 3009-3021 (2013).
  5. Wilhite, R., et al. Platelet phosphorylated TDP-43: an exploratory study for a peripheral surrogate biomarker development for Alzheimer’s disease. Future Science OA. 3 (4), 238 (2017).
  6. Worth, A. J., et al. LC-MS Analysis of Human Platelets as a Platform for Studying Mitochondrial Metabolism. Journal of Visualized Experiments. (110), e53941 (2016).
  7. Statland, J. M., et al. Rasagiline for amyotrophic lateral sclerosis: A randomized, controlled trial. Muscle and Nerve. 59 (2), 201-207 (2019).
  8. Charytan, D. M., et al. Safety and cardiovascular efficacy of spironolactone in dialysis-dependent ESRD (SPin-D): a randomized, placebo-controlled, multiple dosage trial. Kidney International. 95 (4), 973-982 (2019).
  9. Ugras, S. E., Shorter, J. RNA-Binding Proteins in Amyotrophic Lateral Sclerosis and Neurodegeneration. Neurology Research International. , 432780 (2012).
  10. Amador-Ortiz, C., et al. TDP-43 immunoreactivity in hippocampal sclerosis and Alzheimer’s disease. Annal of Neurology. 61 (5), 435-445 (2007).
  11. Baloh, R. H. TDP-43: the relationship between protein aggregation and neurodegeneration in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal lobar degeneration. FEBS Journal. 278 (19), 3539-3549 (2011).
  12. Buratti, E., Baralle, F. E. The molecular links between TDP-43 dysfunction and neurodegeneration. Advances in Genetics. 66, 1-34 (2009).
  13. Guo, W., et al. An ALS-associated mutation affecting TDP-43 enhances protein aggregation, fibril formation and neurotoxicity. Nature Structural Molecular Biology. 18 (7), 822-830 (2011).
  14. Geser, F., et al. Motor neuron disease clinically limited to the lower motor neuron is a diffuse TDP-43 proteinopathy. Acta Neuropathologica. 121 (4), 509-517 (2011).
  15. Neumann, M., et al. Ubiquitinated TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis. Science. 314 (5796), 130-133 (2006).
  16. Buratti, E., Baralle, F. E. TDP-43: gumming up neurons through protein-protein and protein-RNA interactions. Trends in Biochemical Sciences. 37 (6), 237-247 (2012).
  17. Fallini, C., Bassell, G. J., Rossoll, W. The ALS disease protein TDP-43 is actively transported in motor neuron axons and regulates axon outgrowth. Human Molecular Genetics. 21 (16), 3703-3718 (2012).
  18. Ayala, Y. M., et al. Structural determinants of the cellular localization and shuttling of TDP-43. Journal of Cell Sciences. 121, 3778-3785 (2008).
  19. Fiesel, F. C., Kahle, P. J. TDP-43 and FUS/TLS: cellular functions and implications for neurodegeneration. FEBS Journal. 278 (19), 3550-3568 (2011).
  20. Birsa, N., Bentham, M. P., Fratta, P. Cytoplasmic functions of TDP-43 and FUS and their role in ALS. Seminars in Cell and Development Biology. , (2019).
  21. Liachko, N. F., et al. CDC7 inhibition blocks pathological TDP-43 phosphorylation and neurodegeneration. Annals of Neurology. 74 (1), 39-52 (2013).
  22. Qureshi, A. H., et al. Proteomic and phospho-proteomic profile of human platelets in basal, resting state: insights into integrin signaling. PLoS One. 4 (10), 7627 (2009).
  23. Suominen, I., Koivisto, S. Increasing Precision When Pipetting Protein Samples: Assessing Reliability of the Reverse Pipetting Technique. American Laboratory. , (2011).
  24. . Pipetting tool box for life sciences Available from: https://www.mt.com/us/en/home/library/guides/laboratory-division/life-science/pipetting-toolbox-for-life-sciences.html (2019)
  25. Hale, L. J., et al. 3D organoid-derived human glomeruli for personalised podocyte disease modelling and drug screening. Nature Communication. 9 (1), 5167 (2018).
  26. Chen, J. Q., Wakefield, L. M., Goldstein, D. J. Capillary nano-immunoassays: advancing quantitative proteomics analysis, biomarker assessment, and molecular diagnostics. Journal of Translational Medicine. 13, 182 (2015).
  27. Moser, A. C., Hage, D. S. Capillary electrophoresis-based immunoassays: principles and quantitative applications. Electrophoresis. 29 (16), 3279-3295 (2008).
  28. Fourier, A., et al. Development of an automated capillary nano-immunoassay-Simple Western assay-to quantify total TDP43 protein in human platelet samples. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (1), 267-275 (2019).
  29. . Compatibility, S.W.S.A.B Available from: https://www.proteinsimple.com/technical_library.html (2017)

Tags

Capillary ElectrophoresisImmunoassayBiomarkersAmyotrophic Lateral SclerosisALSHuman PlateletsHigh-throughputBlood-based BiomarkerClinical TrialsProtein ProfilingDrug Monitoring

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Sage, J. M., Hall, L., McVey, A., Barohn, R. J., Statland, J. M., Jawdat, O., Dimachkie, M. M., Agbas, A. Use of Capillary Electrophoresis Immunoassay to Search for Potential Biomarkers of Amyotrophic Lateral Sclerosis in Human Platelets. J. Vis. Exp. (156), e60638, doi:10.3791/60638 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image