Screening per inibitori di Pirofosofasi rilegati a Thermotoga
Summary
Qui presentiamo un metodo di screening per gli inibitori di pyrophosphatase legati alla membrana (da Thermotoga maritima) basato sulla reazione blu molybdenum in un formato 96 pozzo piastra.
Abstract
I piifofosti legati alla membrana (mPPases) sono enzimi dimerici che si verificano nei batteri, negli arcai, nelle piante e nei parassiti protisti. Queste proteine si sciolgono il pirofosfato in due molecole di ortopofosde, che è accoppiato con protone e/o ione di sodio che pompa attraverso la membrana. Poiché non si verificano proteine omologhe negli animali e negli esseri umani, gli mPPasi e sono buoni candidati nella progettazione di potenziali bersagli farmacologici. Qui presentiamo un protocollo dettagliato per lo screening per gli inibitori mPPase utilizzando la reazione blu molybdenum in un sistema di piastra 96. Usiamo mPPase dal batterio termofilo Thermotoga maritima (TmPPase) come enzima modello. Questo protocollo è semplice ed economico, producendo un risultato coerente e robusto. Ci vuole solo circa un’ora per completare il protocollo di analisi dell’attività dall’inizio del saggio fino alla misurazione dell’assorbimento. Poiché il colore blu prodotto in questo saggio è stabile per un lungo periodo di tempo, il saggio successivo può essere eseguito immediatamente dopo il lotto precedente e l’assorbimento può essere misurato in un secondo momento per tutti i lotti contemporaneamente. Lo svantaggio di questo protocollo è che è fatto manualmente e quindi può essere estenuante così come richiedono buone abilità di pipettaggio e di mantenimento del tempo. Inoltre, la soluzione arsenite-citrate utilizzata in questo saggio contiene arsenite di sodio, che è tossico e deve essere maneggiato con le precauzioni necessarie.
Introduction
Circa il 25% del totale delle proteine cellulari sono proteine di membrana e circa il 60% di esse sono bersagli farmacologici1,2. Uno dei potenziali bersagli farmacologici3, pirofofosasi legati alla membrana (mPPases), sono enzimi dimero che pompano protone e/o ione di sodio attraverso la membrana da idrolisi di piofosfato in due ortoposfati4. mPPases può essere trovato in vari organismi5 come batteri, archea, piante e parassiti protisti, con l’eccezione di esseri umani e animali4. Nei parassiti protisti, per esempio Plasmodium falciparum, Toxoplasma gondii e Trypanosoma brucei, mPPases sono essenziali per la virulenza del parassita6 e knockout di questa espressione nei parassiti portano al fallimento nel mantenimento del pH intracellulare dopo l’esposizione al pH di base esterno7. A causa della loro importanza e della mancanza di proteine omologhe presenti nei vertebrati, mPPases può essere considerato come potenziali bersagli farmacologici per le malattie protische3.
Lo screening in vitro degli inibitori di mPPase in questo lavoro si basa su un sistema modello TmPPase. TmPPase è un mPPasi dipendente dagli ioni di sodio e ioscio da T. maritima e ha la sua attività ottimale a 71 gradi centigradi8. I benefici di questo enzima sono ad esempio la sua facilità di produzione e purificazione, una buona stabilità termica e un’elevata attività specifica. TmPPase mostra sia un’elevata somiglianza oltre alla completa conservazione della posizione, sia l’identità di tutti i residui catalitici al protista mPPases3,9 e la struttura risolta di Vigna radiata10 mPPase. Le strutture disponibili di TmPPase in diverse conformazioni sono utili anche per l’esperimento di progettazione di farmaci basati sulla struttura (come screening virtuale e progettazione de novo).
Qui segnaliamo un protocollo dettagliato per lo screening degli inibitori di TmPPase in un formato 96 ben piatto (Figura 1). Il protocollo si basa sul metodo colorimetrico della reazione blu molybdenum, che è stato sviluppato per la prima volta da Fiske e Subbarow11. Questo metodo comporta la formazione di 12-ciclomolistici da ortopofosfato e molybdate in condizioni acide, che viene poi ridotto per dare caratteristiche specie di fosfomilybdenum di colore blu12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui riportiamo un protocollo dettagliato per lo screening semplice degli inibitori per la pirofosasi legata alla membrana da T. maritima in un formato 96 pozzo basato su Vidilaseris et al.14. Questo protocollo è poco costoso e basato su 12-acido fosforolismibdico, che è formato da ortopofosfato e molybdate in condizioni acide e ridotto a specie di fosfomilybdenum con un colore blu distinto12. Questo metodo è preferito rispetto ad altri protocolli, come il più s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni della Jane and Aatos Erkko Foundation e della BBSRC (BB/M021610) ad Adrian Goldman, l’Accademia di Finlandia (n. 308105) a Keni Vidilaseris, (n. 310297) a Henri Xhaard, e (n. 265481) a Jari Yli-Kauhaluoma, e l’Università di Helsinki Fondi di Ricerca a Gustav Boije af Gennàs. Gli autori ringraziano Bernadette Gehl per il suo aiuto tecnico durante il progetto.
Materials
| Adhesive sealing sheet | Thermo Scientific | AB0558 | |
| Ammonium heptamolybdate tetrahydrate | Merck | F1412481 636 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | 95212-250G | |
| BioLite 96Well Multidish | Thermo Scientific | 130188 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Merck | 1167431000 | |
| 8-well PCR Tube Strips 0.2 ml without caps (120) | Nippon genetics | FG-028 | |
| Dodecyl maltoside (DDM) | Melford | B2010-100G | |
| Ethanol | Merck | 1009901001 | |
| Glacial acetic acid | Merck | 1000631011 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148-500ML | |
| Imidodiphosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | I0631-1G | |
| L-α-Phosphatidyl choline from soybean lecithin | Sigma | 429415-100GM | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 8147330500 | |
| Multiplate 96-Well PCR Plates | Bio-Rad | MLL9651 | |
| MultiSkan Go | Thermo Scientific | 10680879 | |
| Nepheloskan Ascent (Type 750) | Labsystems | ||
| Polystyrene Petri dish (size 150 mm x 15 mm) | Sigma-Aldrich | P5981-100EA | |
| Potassium chloride | Merck | 104936 | |
| Prism 6 software | GraphPad | ||
| QBT2 Heating block | Grant Instruments | ||
| Sodium meta-arsenite | Fisher Chemical | 12897692 | |
| Sodium phosphate dibasic (Pi) | Sigma | S0876-1KG | |
| Sodium pyrophosphate dibasic | Fluka | 71501-100G | |
| Trisodium citrate dihydrate | Fluka | 71404-1KG |
References
- Terstappen, G. C., Reggiani, A. In silico research in drug discovery. Trends in Pharmacological Sciences. 22 (1), 23-26 (2001).
- Rask-Andersen, M., Almen, M. S., Schioth, H. B. Trends in the exploitation of novel drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (8), 579-590 (2011).
- Shah, N. R., Vidilaseris, K., Xhaard, H., Goldman, A. Integral membrane pyrophosphatases: a novel drug target for human pathogens. AIMS Biophysics. 3 (1), 171-194 (2016).
- Baykov, A. A., Malinen, A. M., Luoto, H. H., Lahti, R. Pyrophosphate-Fueled Na+ and H+ Transport in Prokaryotes. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 77 (2), 267-276 (2013).
- Serrano, A., Perez-Castineira, J. R., Baltscheffsky, M., Baltscheffsky, H. H+-PPases: yesterday, today and tomorrow. IUBMB Life. 59 (2), 76-83 (2007).
- Liu, J., et al. A vacuolar-H+-pyrophosphatase (TgVP1) is required for microneme secretion, host cell invasion, and extracellular survival of Toxoplasma gondii. Molecular Microbiology. 93 (4), 698-712 (2014).
- Lemercier, G., et al. A pyrophosphatase regulating polyphosphate metabolism in acidocalcisomes is essential for Trypanosoma brucei virulence in mice. Journal of Biological Chemistry. 279 (5), 3420-3425 (2004).
- Belogurov, G. A., et al. Membrane-bound pyrophosphatase of Thermotoga maritima requires sodium for activity. Biochemistry. 44 (6), 2088-2096 (2005).
- Vidilaseris, K., et al. Asymmetry in catalysis by Thermotoga maritima membrane-bound pyrophosphatase demonstrated by a nonphosphorus allosteric inhibitor. Science Advances. 5 (5), (2019).
- Lin, S. M., et al. Crystal structure of a membrane-embedded H+-translocating pyrophosphatase. Nature. 484 (7394), 399-403 (2012).
- Fiske, C. H., Subbarow, Y. The colorimetric determination of phosphorus. Journal of Biological Chemistry. 66 (2), 375-400 (1925).
- Nagul, E. A., McKelvie, I. D., Worsfold, P., Kolev, S. D. The molybdenum blue reaction for the determination of orthophosphate revisited: Opening the black box. Analytica Chimica Acta. 890, 60-82 (2015).
- Kellosalo, J., Kajander, T., Palmgren, M. G., Lopez-Marques, R. L., Goldman, A. Heterologous expression and purification of membrane-bound pyrophosphatases. Protein Expression and Purification. 79 (1), 25-34 (2011).
- Vidilaseris, K., Kellosalo, J., Goldman, A. A high-throughput method for orthophosphate determination of thermostable membrane-bound pyrophosphatase activity. Analytical Methods. 10 (6), 646-651 (2018).
- He, Z. Q., Honeycutt, C. W. A modified molybdenum blue method for orthophosphate determination suitable for investigating enzymatic hydrolysis of organic phosphates. Communications in Soil Science and Plant Analysis. 36 (9-10), 1373-1383 (2005).
- Martin, B., Pallen, C. J., Wang, J. H., Graves, D. J. Use of fluorinated tyrosine phosphates to probe the substrate specificity of the low molecular weight phosphatase activity of calcineurin. Journal of Biological Chemistry. 260 (28), 14932-14937 (1985).
- Strauss, J., Wilkinson, C., Vidilaseris, K., Harborne, S. P. D., Goldman, A. A simple strategy to determine the dependence of membrane-bound pyrophosphatases on K+ as a cofactor. Methods in Enzymology. 607, 131-156 (2018).
