הקרנה עבור התרמוטוגה מארימה ממברנה מאוגדות פירופוספטאז מעכבי
Summary
כאן אנו מציגים שיטת ההקרנה עבור פירופוספאז ממברנה הממברנה (מתוך מעכבי התרמוטוגה) על בסיס מוליבדן תגובה כחולה בפורמט 96 צלחת היטב.
Abstract
פירופוספטסיס ממברנה (mPPases) הם אנזימים dimeric המתרחשים בחיידקים, הארכאית, צמחים, וטפילים פרוטיסטים. חלבונים אלה קליב פירופוספט לשתי מולקולות אורתופהונאים, אשר בשילוב עם פרוטון ו/או נתרן שאיבה על פני קרום. מכיוון שאין חלבונים הומוולוגיים להופיע בבעלי חיים ובבני אדם, mPPases הם מועמדים טובים בעיצוב של מטרות סמים פוטנציאליים. כאן אנו מציגים פרוטוקול מפורט למסך עבור מעכבי mPPase ניצול מוליבדן תגובה כחולה במערכת 96 צלחת היטב. אנו משתמשים mPPase מן החיידק תרמופילית תרמוטוגה מארימה (tmppase) כאנזים מודל. פרוטוקול זה הוא פשוט וזול, הפקת תוצאה עקבית ואיתנה. זה לוקח רק שעה אחת כדי להשלים את פרוטוקול התאמת הפעילות מתחילתו של הסדר עד המדידה ספיגת. כיוון שהצבע הכחול המיוצר בתוך מעשה זה יציב למשך פרק זמן ארוך, ניתן לבצע את הפעולות הבאות מיד לאחר האצווה הקודמת, וניתן למדוד את הספיגה מאוחר יותר עבור כל הקבוצות בו. החיסרון של פרוטוקול זה הוא שזה נעשה באופן ידני ולכן יכול להיות מתיש, כמו גם לדרוש כישורים טובים של ליטוף ושמירה זמן. יתר על כן, התמיסה ארגיט-ציטראט המשמשת בטיפול זה מכילה נתרן ארגיט, שהוא רעיל ויש לטפל בו באמצעי זהירות נחוצים.
Introduction
כ -25% של החלבונים הסלולריים הכולל הם חלבונים ממברנה ו 60% מהם הם מטרות התרופה1,2. אחת ממטרות התרופה הפוטנציאלית3, ממברנה מאוגד פירופוספסים (mppases הם אנזימים dimeric המשאבה פרוטון ו/או נתרן יון על ידי הידרוליזה של פירופוספט לשניאורטופד 4. mPPases ניתן למצוא אורגניזמים שונים5 כגון חיידקים, הארכונים, צמחים, וטפילים פרוטיסטים, למעט בני אדם ובעלי חיים4. ב טפילים פרוטיסטים, למשל פלמודיום falciparum, טוקסופלזמה gondii ו טריאנוסומה ברוסייאי, mppasesהם חיוניים עבור התקפה ואלימה הטפיל6 ו נוקאאוט של ביטוי זה טפילים להוביל לכישלון בשמירה על חומציות תאיים על חשיפה ל-ph הבסיסי החיצוני7. בשל חשיבותם וחוסר חלבון הומולוגי המצויים בחוליות, ניתן להתייחס ל-mPPases כמטרות התרופות הפוטנציאליות עבור מחלות הפרוסטל3.
הקרנת חוץ גופית של מעכבי mPPase בעבודה זו מבוססת על מערכת מודל TmPPase. Tmppase הוא שאיבה יון נתרן ומיון אשלגן תלוי mppase מ T. קיסריה ויש לו פעילות אופטימלית ב 71 ° צ’8. היתרונות של אנזים זה הם למשל הקלות שלה בייצור וטיהור, יציבות תרמית טובה ופעילות מסוימת גבוהה. Tmppase מראה גם דמיון גבוה בנוסף על שימור מוחלט של העמדה, כמו גם זהות של כל שאריות קטליטי כדי mpp,התלת ממדי 3,9 ולמבנה פתרו של ויגו radiata10 mppase. המבנים הזמינים של TmPPase בקונמציות שונות הן גם שימושיות עבור ניסוי מבוסס מבנה התרופה עיצוב (כמו הקרנה וירטואלית דה נובו עיצוב).
כאן אנו מדווחים על פרוטוקול מפורט להקרנה של מעכבי TmPPase ב 96 בפורמט צלחת הבאר (איור 1). הפרוטוקול מבוסס על שיטת הצביעה של התגובה הכחולה מוליבדן, אשר פותחה לראשונה על ידי פיסק ו Subbarow11. שיטה זו כוללת את היווצרות של 12-פוספוליפוליב חומצה בmolybdate באמצעות מצבים חומציים, אשר מופחת אז לתת מינים אופייני בצבע כחול phosphomolybdenum12.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן אנו מדווחים על פרוטוקול מפורט עבור הקרנה פשוטה של מעכבי עבור פירופוספאז של קרום מאוגד מ T. קיסריה בפורמט 96 צלחת היטב מבוסס על vidilaseris ואח ‘14. פרוטוקול זה הוא זול ובעל בסיס של 12-פוספומוליפוליב חומצה, אשר נוצרת מאורתופדיה וmolybdate בתנאים חומציים ומופחתת למינים phosphomolybdenum עם צ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי המענקים מקרן ג’יין ואטוס Erkko ו-BBSRC (BB/M021610) לאדריאן גולדמן, האקדמיה של פינלנד (No. 308105) ל Keni Vidilaseris, (מס ‘ 310297) לאנרי Xhaard, ו (No. 265481) כדי Jari Yli-Kauhaluoma, ואת אוניברסיטת הלסינקי כספי מחקר כדי גוסטב Boije af Gennäs. המחברים מודים לברנדט גהל על עזרתה הטכנית במהלך הפרויקט.
Materials
| Adhesive sealing sheet | Thermo Scientific | AB0558 | |
| Ammonium heptamolybdate tetrahydrate | Merck | F1412481 636 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | 95212-250G | |
| BioLite 96Well Multidish | Thermo Scientific | 130188 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Merck | 1167431000 | |
| 8-well PCR Tube Strips 0.2 ml without caps (120) | Nippon genetics | FG-028 | |
| Dodecyl maltoside (DDM) | Melford | B2010-100G | |
| Ethanol | Merck | 1009901001 | |
| Glacial acetic acid | Merck | 1000631011 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148-500ML | |
| Imidodiphosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | I0631-1G | |
| L-α-Phosphatidyl choline from soybean lecithin | Sigma | 429415-100GM | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 8147330500 | |
| Multiplate 96-Well PCR Plates | Bio-Rad | MLL9651 | |
| MultiSkan Go | Thermo Scientific | 10680879 | |
| Nepheloskan Ascent (Type 750) | Labsystems | ||
| Polystyrene Petri dish (size 150 mm x 15 mm) | Sigma-Aldrich | P5981-100EA | |
| Potassium chloride | Merck | 104936 | |
| Prism 6 software | GraphPad | ||
| QBT2 Heating block | Grant Instruments | ||
| Sodium meta-arsenite | Fisher Chemical | 12897692 | |
| Sodium phosphate dibasic (Pi) | Sigma | S0876-1KG | |
| Sodium pyrophosphate dibasic | Fluka | 71501-100G | |
| Trisodium citrate dihydrate | Fluka | 71404-1KG |
References
- Terstappen, G. C., Reggiani, A. In silico research in drug discovery. Trends in Pharmacological Sciences. 22 (1), 23-26 (2001).
- Rask-Andersen, M., Almen, M. S., Schioth, H. B. Trends in the exploitation of novel drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (8), 579-590 (2011).
- Shah, N. R., Vidilaseris, K., Xhaard, H., Goldman, A. Integral membrane pyrophosphatases: a novel drug target for human pathogens. AIMS Biophysics. 3 (1), 171-194 (2016).
- Baykov, A. A., Malinen, A. M., Luoto, H. H., Lahti, R. Pyrophosphate-Fueled Na+ and H+ Transport in Prokaryotes. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 77 (2), 267-276 (2013).
- Serrano, A., Perez-Castineira, J. R., Baltscheffsky, M., Baltscheffsky, H. H+-PPases: yesterday, today and tomorrow. IUBMB Life. 59 (2), 76-83 (2007).
- Liu, J., et al. A vacuolar-H+-pyrophosphatase (TgVP1) is required for microneme secretion, host cell invasion, and extracellular survival of Toxoplasma gondii. Molecular Microbiology. 93 (4), 698-712 (2014).
- Lemercier, G., et al. A pyrophosphatase regulating polyphosphate metabolism in acidocalcisomes is essential for Trypanosoma brucei virulence in mice. Journal of Biological Chemistry. 279 (5), 3420-3425 (2004).
- Belogurov, G. A., et al. Membrane-bound pyrophosphatase of Thermotoga maritima requires sodium for activity. Biochemistry. 44 (6), 2088-2096 (2005).
- Vidilaseris, K., et al. Asymmetry in catalysis by Thermotoga maritima membrane-bound pyrophosphatase demonstrated by a nonphosphorus allosteric inhibitor. Science Advances. 5 (5), (2019).
- Lin, S. M., et al. Crystal structure of a membrane-embedded H+-translocating pyrophosphatase. Nature. 484 (7394), 399-403 (2012).
- Fiske, C. H., Subbarow, Y. The colorimetric determination of phosphorus. Journal of Biological Chemistry. 66 (2), 375-400 (1925).
- Nagul, E. A., McKelvie, I. D., Worsfold, P., Kolev, S. D. The molybdenum blue reaction for the determination of orthophosphate revisited: Opening the black box. Analytica Chimica Acta. 890, 60-82 (2015).
- Kellosalo, J., Kajander, T., Palmgren, M. G., Lopez-Marques, R. L., Goldman, A. Heterologous expression and purification of membrane-bound pyrophosphatases. Protein Expression and Purification. 79 (1), 25-34 (2011).
- Vidilaseris, K., Kellosalo, J., Goldman, A. A high-throughput method for orthophosphate determination of thermostable membrane-bound pyrophosphatase activity. Analytical Methods. 10 (6), 646-651 (2018).
- He, Z. Q., Honeycutt, C. W. A modified molybdenum blue method for orthophosphate determination suitable for investigating enzymatic hydrolysis of organic phosphates. Communications in Soil Science and Plant Analysis. 36 (9-10), 1373-1383 (2005).
- Martin, B., Pallen, C. J., Wang, J. H., Graves, D. J. Use of fluorinated tyrosine phosphates to probe the substrate specificity of the low molecular weight phosphatase activity of calcineurin. Journal of Biological Chemistry. 260 (28), 14932-14937 (1985).
- Strauss, J., Wilkinson, C., Vidilaseris, K., Harborne, S. P. D., Goldman, A. A simple strategy to determine the dependence of membrane-bound pyrophosphatases on K+ as a cofactor. Methods in Enzymology. 607, 131-156 (2018).
