Screening voor Thermotoga maritima -membraan afhankelijke Pyrofosfatase remmers
Summary
Hier presenteren we een screeningsmethode voor membraan-gebonden pyrofosfatase (van Thermotoga maritima) remmers op basis van de molybdeen blauwe reactie in een 96 goed plaat formaat.
Abstract
Het membraan gebonden pyrofosfatasen (mPPases) zijn dimere enzymen die voorkomen bij bacteriën, Archaea, planten en protist parasieten. Deze eiwitten klieven pyrofosfaat in twee orthofosfaatmoleculen, die gepaard gaat met proton en/of natriumionen die over het membraanpompen. Omdat er geen homologe eiwitten voorkomen bij dieren en mensen, zijn mPPases goede kandidaten in het ontwerp van potentiële geneesmiddel doelen. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor het scherm voor mPPase-remmers met behulp van de molybdeen blauwe reactie in een 96 goed plaat systeem. We gebruiken mPPase van de thermofiele bacterie Thermo toga maritima (tmppase) als een model enzym. Dit protocol is eenvoudig en goedkoop en produceert een consistent en robuust resultaat. Het duurt slechts ongeveer een uur om het activity assay protocol te voltooien vanaf het begin van de assay tot de extinctie meting. Aangezien de blauwe kleur die in deze test wordt geproduceerd gedurende een lange periode stabiel is, kunnen de volgende test (s) onmiddellijk na de vorige batch worden uitgevoerd en kan de extinctie later voor alle batches tegelijk worden gemeten. Het nadeel van dit protocol is dat het handmatig wordt gedaan en dus kan worden vermoeiend en vereisen goede vaardigheden van pipetteren en tijd houden. Bovendien bevat de in deze bepaling gebruikte arseniet-citraatoplossing natrium arseniet, wat giftig is en met de nodige voorzorgsmaatregelen moet worden behandeld.
Introduction
Ongeveer 25% van de totale cellulaire eiwitten zijn membraan eiwitten en ongeveer 60% van hen zijn drug targets1,2. Een van de potentiële drug targets3, membraangebonden pyrofosfatasen (mPPases), zijn dimere enzymen die proton en/of natrium ion over het membraanpompen door hydrolyse van pyrofosfaat in twee orthofosfaataten4. mPPases kan worden gevonden in verschillende organismen5 zoals bacteriën, Archaea, planten, en protist parasieten, met uitzondering van mensen en dieren4. Bij protist parasieten, bijvoorbeeld Plasmodium falciparum, Toxoplasma gondii en Trypanosoma brucei, zijn mppases essentieel voor de parasiet virulentie6 en Knockout van deze expressie in de parasieten leiden tot falen bij het handhaven van intracellulaire pH bij blootstelling aan de uitwendige basis pH7. Vanwege hun belang en gebrek aan homologe eiwitten die aanwezig zijn in gewervelde dieren, kunnen mPPases worden beschouwd als potentiële geneesmiddel doelen voor protistal ziekten3.
De in vitro screening van mPPase-remmers in dit werk is gebaseerd op een TmPPase-modelsysteem. TmPPase is een natrium-ion-pomp en kalium-ion-afhankelijke mPPase van T. maritima en heeft zijn optimale activiteit bij 71 °c8. Voordelen van dit enzym zijn bijvoorbeeld het gemak in de productie en zuivering, goede thermische stabiliteit en hoge specifieke activiteit. Tmppase vertoont zowel een hoge gelijkenis als de volledige instandhouding van de positie en de identiteit van alle katalytische residuen aan de protist mppases3,9 en aan de opgeloste structuur van Vigna radiata10 mppase. De beschikbare structuren van TmPPase in verschillende conformaties zijn ook nuttig voor structuur gebaseerde drug design experiment (als virtuele screening en de Novo ontwerp).
Hier rapporteren we een gedetailleerd protocol voor het screenen van TmPPase remmers in een 96 goed plaat formaat (Figuur 1). Het protocol is gebaseerd op de colorimetrische methode van de molybdeen-blauwe reactie, die voor het eerst werd ontwikkeld door Fiske en Subbarow11. Deze methode omvat de vorming van 12-fosforzuurzuur uit het ORTHOFOSFAAT en molybdaat onder zure omstandigheden, die vervolgens wordt gereduceerd tot karakteristieke blauw kleurige fosforolybdenum soorten12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier rapporteren we een gedetailleerd protocol voor eenvoudige screening van remmers voor membraan-gebonden pyrofosfatase van T. maritima in een 96 goed plaat formaat op basis van Vidilaseris et al.14. Dit protocol is goedkoop en gebaseerd op 12-fosforolybdisch zuur, dat wordt gevormd uit ORTHOFOSFAAT en molybdaat onder zure omstandigheden en gereduceerd tot fosforolybdenum soorten met een duidelijke blauwe kleur12. Deze methode heeft de voorkeur boven andere proto…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door de subsidies van de Jane en Aatos Erkko Foundation en de BBSRC (BB/M021610) aan Adrian Goldman, de Academie van Finland (nr. 308105) aan Keni Vidilaseris, (nr. 310297) aan Henri Xhaard, en (nr. 265481) aan Jari Yli-Kauhaluoma, en de studie fondsen van de Universiteit van Helsinki aan Gustav boije af Gennäs. De auteurs danken Bernadette Gehl voor haar technische hulp tijdens het project.
Materials
| Adhesive sealing sheet | Thermo Scientific | AB0558 | |
| Ammonium heptamolybdate tetrahydrate | Merck | F1412481 636 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | 95212-250G | |
| BioLite 96Well Multidish | Thermo Scientific | 130188 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Merck | 1167431000 | |
| 8-well PCR Tube Strips 0.2 ml without caps (120) | Nippon genetics | FG-028 | |
| Dodecyl maltoside (DDM) | Melford | B2010-100G | |
| Ethanol | Merck | 1009901001 | |
| Glacial acetic acid | Merck | 1000631011 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148-500ML | |
| Imidodiphosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | I0631-1G | |
| L-α-Phosphatidyl choline from soybean lecithin | Sigma | 429415-100GM | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 8147330500 | |
| Multiplate 96-Well PCR Plates | Bio-Rad | MLL9651 | |
| MultiSkan Go | Thermo Scientific | 10680879 | |
| Nepheloskan Ascent (Type 750) | Labsystems | ||
| Polystyrene Petri dish (size 150 mm x 15 mm) | Sigma-Aldrich | P5981-100EA | |
| Potassium chloride | Merck | 104936 | |
| Prism 6 software | GraphPad | ||
| QBT2 Heating block | Grant Instruments | ||
| Sodium meta-arsenite | Fisher Chemical | 12897692 | |
| Sodium phosphate dibasic (Pi) | Sigma | S0876-1KG | |
| Sodium pyrophosphate dibasic | Fluka | 71501-100G | |
| Trisodium citrate dihydrate | Fluka | 71404-1KG |
References
- Terstappen, G. C., Reggiani, A. In silico research in drug discovery. Trends in Pharmacological Sciences. 22 (1), 23-26 (2001).
- Rask-Andersen, M., Almen, M. S., Schioth, H. B. Trends in the exploitation of novel drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (8), 579-590 (2011).
- Shah, N. R., Vidilaseris, K., Xhaard, H., Goldman, A. Integral membrane pyrophosphatases: a novel drug target for human pathogens. AIMS Biophysics. 3 (1), 171-194 (2016).
- Baykov, A. A., Malinen, A. M., Luoto, H. H., Lahti, R. Pyrophosphate-Fueled Na+ and H+ Transport in Prokaryotes. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 77 (2), 267-276 (2013).
- Serrano, A., Perez-Castineira, J. R., Baltscheffsky, M., Baltscheffsky, H. H+-PPases: yesterday, today and tomorrow. IUBMB Life. 59 (2), 76-83 (2007).
- Liu, J., et al. A vacuolar-H+-pyrophosphatase (TgVP1) is required for microneme secretion, host cell invasion, and extracellular survival of Toxoplasma gondii. Molecular Microbiology. 93 (4), 698-712 (2014).
- Lemercier, G., et al. A pyrophosphatase regulating polyphosphate metabolism in acidocalcisomes is essential for Trypanosoma brucei virulence in mice. Journal of Biological Chemistry. 279 (5), 3420-3425 (2004).
- Belogurov, G. A., et al. Membrane-bound pyrophosphatase of Thermotoga maritima requires sodium for activity. Biochemistry. 44 (6), 2088-2096 (2005).
- Vidilaseris, K., et al. Asymmetry in catalysis by Thermotoga maritima membrane-bound pyrophosphatase demonstrated by a nonphosphorus allosteric inhibitor. Science Advances. 5 (5), (2019).
- Lin, S. M., et al. Crystal structure of a membrane-embedded H+-translocating pyrophosphatase. Nature. 484 (7394), 399-403 (2012).
- Fiske, C. H., Subbarow, Y. The colorimetric determination of phosphorus. Journal of Biological Chemistry. 66 (2), 375-400 (1925).
- Nagul, E. A., McKelvie, I. D., Worsfold, P., Kolev, S. D. The molybdenum blue reaction for the determination of orthophosphate revisited: Opening the black box. Analytica Chimica Acta. 890, 60-82 (2015).
- Kellosalo, J., Kajander, T., Palmgren, M. G., Lopez-Marques, R. L., Goldman, A. Heterologous expression and purification of membrane-bound pyrophosphatases. Protein Expression and Purification. 79 (1), 25-34 (2011).
- Vidilaseris, K., Kellosalo, J., Goldman, A. A high-throughput method for orthophosphate determination of thermostable membrane-bound pyrophosphatase activity. Analytical Methods. 10 (6), 646-651 (2018).
- He, Z. Q., Honeycutt, C. W. A modified molybdenum blue method for orthophosphate determination suitable for investigating enzymatic hydrolysis of organic phosphates. Communications in Soil Science and Plant Analysis. 36 (9-10), 1373-1383 (2005).
- Martin, B., Pallen, C. J., Wang, J. H., Graves, D. J. Use of fluorinated tyrosine phosphates to probe the substrate specificity of the low molecular weight phosphatase activity of calcineurin. Journal of Biological Chemistry. 260 (28), 14932-14937 (1985).
- Strauss, J., Wilkinson, C., Vidilaseris, K., Harborne, S. P. D., Goldman, A. A simple strategy to determine the dependence of membrane-bound pyrophosphatases on K+ as a cofactor. Methods in Enzymology. 607, 131-156 (2018).
