Summary

Kombination von Laser Capture Microdissection und Microfluidic qPCR zur Analyse von Transkriptionsprofilen einzelner Zellen: Ein systembiologischer Ansatz zur Opioidabhängigkeit

Published: March 08, 2020
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Summary

Dieses Protokoll erklärt, wie einzelne Neuronen, Mikroglia und Astrozyten aus dem zentralen Kern der Amygdala mit hoher Genauigkeit und anatomischer Spezifität mit Laser-Capture-Mikrodissektion zu sammeln. Darüber hinaus erklären wir unsere Verwendung von mikrofluidischem RT-qPCR, um eine Teilmenge des Transkriptoms dieser Zellen zu messen.

Abstract

Die tiefgreifende transkriptionelle Heterogenität in anatomisch angrenzenden Einzelzellen legt nahe, dass eine robuste Gewebefunktionalität durch zelluläre Phänotypvielfalt erreicht werden kann. Einzelzellige Experimente, die die Netzwerkdynamik biologischer Systeme untersuchen, zeigen zelluläre und Gewebereaktionen auf verschiedene Bedingungen bei biologisch sinnvoller Auflösung. Hierin erklären wir unsere Methoden zur Sammlung einzelner Zellen an anatomisch spezifischen Stellen und zur genauen Messung einer Teilmenge ihrer Genexpressionsprofile. Wir kombinieren Lasercapture Microdissection (LCM) mit mikrofluidischen Reverse Transkriptionsquantitativepolymerase-Kettenreaktionen (RT-qPCR). Wir verwenden diese mikrofluidische RT-qPCR-Plattform, um die mikrobielle Fülle von Darminhalten zu messen.

Introduction

Die Messung der Genexpressionsprofile einzelner Zellen hat eine umfassende phänotypische Heterogenität innerhalb eines Gewebes gezeigt. Diese Komplexität hat unser Verständnis der biologischen Netzwerke, die die Gewebefunktion steuern, erschwert. Unsere Gruppe und andere haben dieses Phänomen in vielen Geweben und Bedingungen1,2,3,4,5,6untersucht. Diese Experimente deuten nicht nur darauf hin, dass die Regulierung von Genexpressionsnetzwerken einer solchen Heterogenität zugrunde liegt, sondern auch, dass die einzellige Auflösung eine Komplexität in der Gewebefunktion offenbart, die die Gewebeauflösung nicht zu schätzen weiß. Tatsächlich kann nur eine kleine Minderheit von Zellen auf eine bestimmte Erkrankung oder Herausforderung reagieren, aber die Auswirkungen dieser Zellen auf die allgemeine Physiologie können erheblich sein. Darüber hinaus kann ein systembiologischer Ansatz, der multivariate Methoden auf hochdimensionale Datasets aus mehreren Zelltypen und Geweben anwendet, systemweite Behandlungseffekte aufklären.

Wir kombinieren LCM und mikrofluidische RT-qPCR, um solche Datensätze zu erhalten. Wir verfolgen diesen Ansatz hier im Gegensatz zur Erfassung einzelner Zellen über fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) und der Verwendung von RNA-Sequenzierung (RNA-Seq), um ihr Transkriptom zu messen. Der Vorteil von LCM gegenüber FACS ist, dass die exakte anatomische Spezifität einzelner Zellen mit LCM relativ und absolut dokumentiert werden kann. Während RNA-seq mehr Funktionen messen kann, als RT-qPCR, ist der mikrofluidische RT-qPCR kostengünstiger und hat eine höhere Empfindlichkeit und Spezifität7.

In diesem repräsentativen Experiment untersuchten wir die Auswirkungen von Opioidabhängigkeit und Naltrexon-gefälltem Opioidentzug auf die neuronale, mikroglia und astrozyte Genexpression der Ratte im zentralen Kern der Amygdala (CeA) und Darmmikroflora Fülle4. Vier Behandlungsgruppen wurden analysiert: 1) Placebo, 2) Morphin, 3) Naltrexon und 4) Entzug (Abbildung 1). Wir fanden heraus, dass die Opioidabhängigkeit die Genexpression nicht wesentlich verändert, sondern dass der Opioid-Entzug die Expression entzündlicher Gene, insbesondere Tnf, induzierte. Astrozyten waren der am stärksten betroffene Zelltyp. Das Darmmikrobiom wurde durch Opioid-Entzug stark beeinflusst, wie durch eineAbnahme des Firmicutes-Zu-Bacteroides-Verhältnisses angezeigt wird, das ein etablierter Marker für Darmdysbiose8,9 ist.

Protocol

Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit den Empfehlungen des Animal Care and Use Committee (IACUC) der Thomas Jefferson University und des Drexel University College of Medicine durchgeführt. Das Protokoll wurde von der Thomas Jefferson University und dem Drexel University College of Medicine IACUC genehmigt. 1. Tiermodell Fügen Sie zwei 75 mg langsam freisetzende Morphinsulfat-Pellets oder zwei Placebo-Pellets subkutan bei erwachsenen männlichen Sprague-Dawley-Ratten ein. <…

Representative Results

Die Auswahl der einzelnen Zellen wurde sowohl visuell als auch molekular validiert. Optisch wurde die zelluläre Morphologie vor der Zellsammlung betrachtet. Die gesammelten Zellen wurden dann an der QC-Station betrachtet und der Zellkernfleck (DAPI) überlappte sich mit der einzelligen Selektionsmarkerfluoreszenz. Abbildung 2A zeigt repräsentative Bilder einer Folie mit einem halbherektierten Rattenvorhirn, das das CeA enthält. Nachfolgend…

Discussion

Die Einzelzellbiologie hat die Heterogenität zellulärer Phänotypen und die Robustheit der Gewebefunktion nachgewiesen. Diese Ergebnisse haben Einblicke in die Organisation biologischer Systeme sowohl auf Makro- als auch auf Mikroserskala gegeben. Hier beschreiben wir die Kombination von zwei Methoden, LCM und mikrofluidische qPCR, um einzellige Transkriptom-Maßnahmen zu erhalten, die anatomische Spezifität und Transkriptionsgenauigkeit zu relativ niedrigen Kosten bieten (Abbildung 1). U…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die hier vorgestellten Arbeiten wurden durch die NIH HLB U01 HL133360 an JS und RV, NIDA R21 DA036372 an JS und EVB und T32 AA-007463 an Jan Hoek zur Unterstützung von SJO’S verliehen.

Materials

20X DNA Binding Dye Fluidigm 100-7609 NA
2x GE Assay Loading Reagent Fluidigm 85000802-R NA
48.48 Dynamic Array IFC for Gene Expression Fluidigm BMK-M-48.48 NA
96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression Fluidigm BMK-M-96.96 NA
Anti-Cd11β Antibody Genway Biotech CCEC48 Microglia Stain
Anti-NeuN Antibody, clone A60 EMD Millipore MAB377 Neuronal Stain
ArcturusXT Laser Capture Microdissection System Arcturus NA NA
Biomark HD Fluidigm NA RT-qPCR platform
Bovine Serum Antigen Sigma-Aldrich B4287
CapSure Macro LCM Caps ThermoFisher Scientific LCM0211 NA
CellDirect One-Step qRT-PCR Kit ThermoFisher Scientific 11753500 Lysis buffer solution components
DAPI ThermoFisher Scientific 62248 Nucleus Stain
DNA Suspension Buffer TEKnova T0221
Exonuclease I New Englnad BioLabs, Inc. M0293S NA
ExtracSure Sample Extraction Device ThermoFisher Scientific LCM0208 NA
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides ThermoFisher Scientific 22-037-246 Plain glass slides
GeneAmp Thin-Walled Reaction Tube ThermoFisher Scientific N8010611
GFAP Monoclonal Antibody ThermoFisher Scientific A-21294 Astrocyte Stain
Goat anti-Mouse IgG (H+L), Superclonal™ Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 ThermoFisher Scientific A28175 Seconadry Antibody
IFC Controller Fluidigm NA NA
RNaseOut ThermoFisher Scientific 10777019
SsoFast EvaGreen Supermix with Low Rox Bio-Rad PN 172-5211 Rox master mix
SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit ThermoFisher Scientific 11754250 Contains VILO and SuperScript
T4 Gene 32 Protein New Englnad BioLabs, Inc. M0300S NA
TaqMan PreAmp Master Mix ThermoFisher Scientific 4391128 NA
TE Buffer TEKnova T0225 NA

References

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Cite This Article
O’Sullivan, S. J., Reyes, B. A., Vadigepalli, R., Van Bockstaele, E. J., Schwaber, J. S. Combining Laser Capture Microdissection and Microfluidic qPCR to Analyze Transcriptional Profiles of Single Cells: A Systems Biology Approach to Opioid Dependence. J. Vis. Exp. (157), e60612, doi:10.3791/60612 (2020).

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