Programas de propagación cautiva de mariposas en riesgo para mejorar el conocimiento de la historia de la vida y técnicas eficaces de conservación ex situ

1. Asegurar el cortejo y el apareamiento exitosos de adultos Después de una eclosión exitosa, libere mariposas adultas viables en una jaula de vuelo segura, con protección, con mosquiteo y protegida ubicada en un invernadero con temperatura controlada(Figura Suplementaria 2).NOTA: Los adultos pueden estar marcados en la superficie ventral de las alas con marcadores de tinta permanentes si se desea la identificación de individuos específicos para la separación de líneas genéticas, origen de las existencias, o para la recopilación de datos específicos relacionados con la longevidad del organismo, comportamiento, etcetera. Mientras que las dimensiones exactas de la jaula pueden variar, asegúrese de que hay un amplio espacio para acomodar el material adecuado de la planta de néctar necesario para soportar la densidad de las mariposas adultas housed y proporcionar espacio para que un humano se ponga libremente de pie y pivote alrededor. Más allá de la regulación de la temperatura, asegúrese de que el invernadero es seguro para que pueda proporcionar una segunda capa de contención junto con la protección contra las inclemencias del tiempo (por ejemplo, lluvias intensas, viento). Elevar el material vegetal de néctar en maceta para que no haya más de 30 cm de espacio desde la parte superior interior de la jaula hasta las flores en flor más altas(Figura Suplementaria 2). Esto proporciona un acceso óptimo a los recursos de néctar disponibles, ofrece amplias perchas para adultos y minimiza la actividad de vuelo extraña. Coloque una planta anfitriona en maceta en la jaula de vuelo. Esto garantiza que incluso si se pierde un par acoplado, se pueden recoger los huevos resultantes puestos. Proporcione un flujo de aire constante. Esto mejora la actividad de cortejo y el éxito de apareamiento. En un entorno de invernadero, los sopladores y los ventiladores de circulación de montaje fijo se utilizan mejor para ayudar a mejorar la ventilación y el movimiento del aire. También se puede utilizar una ventilación portátil más pequeña, como ventiladores de caja o de escritorio. Mantener la temperatura interna del invernadero entre 27oC y 32oC para promover una óptima actividad adulta y un éxito de apareamiento. La temperatura dentro de la jaula se controla mediante un termómetro de monitoreo de memoria trazable. Negocie la jaula de vuelo con mosquiteros regularmente (aproximadamente una vez cada 2 h) con agua utilizando una bomba de mano, pulverizador de tanque de plástico o manguera de jardín. Recoja suavemente los pares de apareamiento individuales de la jaula de vuelo con mosquitero utilizando un vial de tapa de presión de plástico transparente de 50 dram(Tabla de materiales),colocando de uno a dos pares por vial, y transporte a una sala de cría interior o laboratorio(Figura suplementaria 3). 2. Maximizar la producción de huevos Montar la cámara de oviposición. Tome una taza de papel blanco normal de 12 onzas y usando un cuchillo utilitario de cuchilla sin presión, haga dos cortes horizontales a cada lado de la copa uno frente al otro. Cada corte debe ser de aproximadamente 1 cm por debajo de la llanta. Cortar un solo hisopo de algodón por la mitad e insertar el extremo de la varilla de cada uno en los dos cortes horizontales a cada lado de la taza de papel para que la porción de hisopo de algodón se extienda aproximadamente 2 cm hacia el interior de la copa. Usando un cuchillo utilitario de cuchilla rápida, haga dos cortes “X” en la parte inferior de la taza de papel. Cada corte diagonal debe ser de aproximadamente 1 cm de largo. Tome una taza de plástico de 9 onzas y llene la parte inferior con aproximadamente 2 cm de agua del grifo. Colocar un corte fresco, de aproximadamente 15 cm de largo, del crecimiento terminal de la planta de host larvario en la copa de papel insertando el tallo a través de uno de los cortes “X” en la parte inferior. Empuje el tallo a través del corte de modo que aproximadamente 4-5 cm sobresalgan por la parte inferior. Coloque la taza de papel con material anfitrión en la taza de plástico, asegurándose de que el tallo de la planta esté en agua. Llene una jeringa sub-Q de 1 ml (0,45 mm x 16 mm) con una bebida deportiva con sabor y sature ambos hisopos de algodón en la taza de papel. Actúan como flores artificiales.NOTA: La bebida deportiva con sabor a melón y ponche de frutas proporciona la mejor alternativa de néctar. Una vez que cada par de apareamiento se separe, coloque 2-3 hembras gravitadas en la configuración de la copa montada (es decir, la cámara de oviposición). Cubra la copa con un fragmento cuadrado cortado de tul negro (aproximadamente 15 cm x 15 cm) y fíjela con una banda de goma alrededor de la tapa(Figura suplementaria 4). El tule negro proporciona la mejor visibilidad de la copa y una fácil identificación de cualquier huevo que ocasionalmente se pueda poner en el tule. Estimular la actividad y la oviposición de las mariposas adultas. Coloque cada cámara de oviposición en un banco de laboratorio o mesa aproximadamente 19 cm por debajo de una luz de sujeción de 8,5 pulgadas (21,59 cm) con un reflector de aluminio que alberga una bombilla incandescente de 40 W(Figura suplementaria 5).NOTA: La luz incandescente proporciona el calor radiante necesario para estimular la actividad y la oviposición de los adultos. Coloque un termómetro de monitoreo de memoria trazable adyacente a las luces y ejecute el sensor de temperatura para que se apoye en la parte superior de una cámara de oviposición situada directamente debajo de una luz de abrazadera.NOTA: El rango de temperatura objetivo está entre 27,5 oC-29 oC. Añada luces de abrazadera suplementarias según sea necesario dependiendo del número total de cámaras oviposicionales desplegadas. Enchufe las luces de abrazadera en un temporizador mecánico enchufable interior programable de 15 amperios 24 h con dos tomas de corriente (programable en intervalos cronometrados de 30 minutos). Ajuste el temporizador para encender la luz de abrazadera durante intervalos de 30 minutos (es decir, un ciclo repetible de 30 min encendido, 30 minutos apagado).NOTA: Este ciclo de luz ayuda a maximizar la producción de óvulos proporcionando períodos repetibles de iluminación para estimular la actividad y la oviposición de las mariposas adultas seguidas de cortos períodos de descanso oscuro. Refresque los hisopos de algodón en cada taza con una bebida deportiva saborizada a través de la jeringa subQ y neblina regularmente con agua usando una botella de spray de plástico aproximadamente cada 2-3 h o según sea necesario.NOTA: Esto proporciona un néctar artificial adecuado y humedad para permitir que las mariposas se alimenten libremente como se desee. Por lo tanto, mejora la longevidad de los adultos y la productividad de oviposición en condiciones de laboratorio donde no se puede utilizar fácilmente material vegetal vivo y en floración. Supervise las tazas regularmente y sustituya la planta anfitriona por esquejes frescos según sea necesario. Cuando los huevos comiencen a eclosionar o la densidad de los huevos se vuelva alta, mueva la(s) hembra(s) a una nueva taza con huésped fresco y comience el protocolo de larvas con neonatos. 3. Cuidado y mantenimiento larvario Repita los pasos 2.3-2.6 para ensamblar tazas para larvas. Cuando los huevos comiencen a eclosionar, mueva el material vegetal huésped con huevos y larvas de neonatos en una taza recién montada, colocando el tallo a través de la segunda “X” en la parte inferior asegurando que el tallo de la planta esté en agua y las hojas toquen el corte de huésped fresco adyacente. Cuando las larvas sean jóvenes (neonate-2 instar), revise las tazas larvales diariamente para ver si hay frescura del material vegetal huésped y presencia de moho o frass excesivo.NOTA: No se recomienda la eliminación diaria de material huésped cuando las larvas son jóvenes, ya que esto puede resultar en lesiones en el organismo debido a la manipulación y / o el desperdicio innecesario de material de huésped fresco. Si el material huésped está marchito o en mal estado, coloque otro corte de material vegetal fresco en la taza para que esté tocando el follaje existente y permita que las larvas se trasladen al nuevo huésped por su cuenta. Una vez que las larvas lleguen a la3a estrella, reemplace la taza de papel y agregue material fresco anfitrión diariamente. Utilice un pequeño cepillo de pintura de acuarela para cabello de camello para mover suavemente las larvas del material huésped antiguo o la superficie de la taza al material anfitrión fresco en la nueva taza. Coloque el material huésped antiguo en un recipiente rectangular vacío de almacenamiento de alimentos de plástico. Repita los pasos 3.5-3.7 al día y hasta que se hayan procesado todas las tazas con larvas. Cuando haya terminado, agregue una pequeña cantidad de material vegetal fresco encima de los desechos de la planta en el contenedor de almacenamiento de alimentos y coloque libremente una tapa en la parte superior.NOTA: Esto sirve como medida de seguridad en caso de que se pase por alto cualquier larva durante el procesamiento diario, ya que se arrastran sobre el nuevo material huésped enla parte superior de los residuos de la planta y se pueden retirar al día siguiente. Mantener las copas a temperatura de laboratorio entre 25oC-28oC para una actividad y desarrollo óptimos de la larva(Figura Suplementaria 6).NOTA: Para alcanzar temperaturas óptimas de cría en condiciones interiores, a menudo es necesario colocar tazas bajo luces de abrazadera con reflectores de aluminio que alojan bombillas incandescentes de 40 W. Las temperaturas se pueden monitorizar activamente utilizando un termómetro de monitorización de memoria trazable y la altura de la luz ajustada para alcanzar condiciones óptimas de cría. 4. Construcción de la cámara de pupación Corte un rollo de papel corrugado de una sola cara en cuadrados de 3,8 cm x 3,8 cm de tamaño igual. Coloque un cuadrado en una porción de plástico transparente de 2 onzas. Coloque la taza en una bandeja de plástico transparente(Figura Suplementaria 7). 5. Preparación de larvas para la pupación Identifique las larvas maduras listas para pupar durante el procesamiento diario de colonias.NOTA: Estas larvas se tornarán de color marrón verdoso uniforme, perderán sus galones y a menudo se alejarán del huésped. Retire suavemente cada larva madura con un pequeño cepillo de pintura de acuarela para cabello de camello o fórceps y coloque una en cada cámara de pupación. Enganche firmemente la tapa de plástico transparente de la cámara de pupación. Repita los pasos 5.1-5.3 hasta que todas las larvas listas para pupar hayan sido transferidas a cámaras de pupación añadiendo nuevas bandejas de plástico según sea necesario(Figura Suplementaria 8). 6. Mantenimiento de las pupupas Para cada bandeja de cámaras de pupación, registre la fecha de la primera pupación y cualquier otra información pertinente necesaria (es decir, línea genética, ensayo experimental, etc.). Organizar las bandejas por fecha y lugar en un lugar seguro dentro del laboratorio(Figura Suplementaria 8). Monitoree las bandejas diariamente para la eclosión de adultos.NOTA: Las condiciones de laboratorio, como la temperatura, influirán fuertemente en el tiempo de desarrollo. Antes de la eclosión adulta (normalmente dentro de los 10 días de la primera cría), retire las tapas de las cámaras de pupación individuales y coloque la bandeja en una jaula de cría emergente de malla plegable de 34,29 cm x 34,29 cm x 60,96 cm (Figura suplementaria 9).NOTA: Las puas fijadas de forma segura dentro de las ranuras de los cuadrados de papel corrugado facilitan la eclosión adulta exitosa(Figura suplementaria 10). Repita el protocolo completo del paso 1.1 para la generación cautiva subsiguiente. 7. Evaluar el tiempo de desarrollo de las etapas inmaduras y el número de estadios Coloque una sola larva bajo un microscopio de disección. Utilice un pequeño cepillo de pintura de acuarela para cabello de camello para mover y aislar cuidadosamente las larvas para evitar lesiones en el organismo. Sumerja un solo pelo del pincel en pintura luminosa no tóxica(Tabla de Materiales),y coloque cuidadosamente una pequeña gota de pintura en la parte posterior (dorsum) de la larva. Utilice un color de pintura que destaque del color de fondo y el color de patrón de la larva(Figura Suplementaria 11). Asegúrese de evitar colocar pintura en la cabeza de la larva. Una vez que la pintura se seque (alrededor de 30 s más o menos), coloque cada larva individual en su propia porción de plástico transparente de 2 onzas que contenga aproximadamente 1-3 hojas pequeñas de material fresco anfitrión terminal y escriba un identificador único en la taza y la tapa(Figura Suplementaria 12). <!–Place approximately 1-3 small leaves of fresh terminal host material into each cup with larva and firmly secure the lid.–> Revise cuidadosamente cada larva diariamente. Retire las hojas y abaste sobre una superficie blanca. Inspeccione la copa, limpie la tapa y examine las hojas bajo un microscopio de disección para detectar la presencia de exuvias larectores (pieles fundidas) y/o cápsulas de la cabeza. Si se encuentra una exuvia larval, retírela de la copa y colóquela en un tubo de microcentrífuga etiquetado con el número de copa correspondiente y la fecha (ver pasos 8.1-8.6. a continuación). Vuelva a pintar las larvas después de cada muda y registre las fechas fundidas. Mida la longitud total del cuerpo (cabeza al último segmento abdominal) de cada larva diariamente usando pinzas digitales. Tome tres mediciones y registre el promedio de los tres, junto con la fecha y la hora. Para las larvas instar tempranas, se debe utilizar una lupa o un alcance de disuado al medir para garantizar mediciones precisas. Devolver la larva a su correspondiente taza de porción de plástico. Agregue material de host fresco según sea necesario y retire todos los residuos de host antiguos y de refriega. Si se encuentra moho en la taza, deseche y use una taza nueva. Escriba el número de identificador único correcto en la nueva taza. Repita los pasos 7.5-7.9 hasta que todas las larvas lleguen a su estrella final y comiencen la etapa prepupal. Cuando las larvas dejan de alimentarse, gire a un color uniforme de color marrón verdoso uniforme, pierda sus galones y a menudo deambule fuera del huésped, minimice los perturbadores. Coloque un pequeño trozo de papel corrugado en la taza (ver paso 4.1). Una vez que cada larva haya pupado completamente, mida su longitud total como en el paso 7.8 anterior y registre la fecha de la pupación. Este será el fundido final de cada individuo. Compruebe las pusias diariamente y registre la fecha de eclosión y el sexo de cada mariposa adulta resultante. Mida la longitud del acorde de ala de cada mariposa usando pinzas digitales. Las mariposas se pueden sujetar suavemente con fórceps para la medición. Si la mariposa está demasiado activa para medirla fácilmente, colóquela temporalmente en un refrigerador durante 30 s o menos e inténtelo de nuevo. 8. Recolectar exuvias larvales Cuando se observe una exuvia larval, llene un tubo de microcentrífuga con 0,2 l de glicerina. Etiquete la parte superior de la tapa y el lado con el número de larva, la fecha de muda y la cápsula de la cabeza (H.C.).NOTA: Las larvas de algunas larvas de lepidópteros consumen regularmente sus exuvias, pero la cápsula de la cabeza debe permanecer. Coloque la exuvia larval y la cápsula de la cabeza asociada en una porción de plástico transparente tapa de la taza y poner un par de gotas de etanol en ella. Examine la exuvia larval bajo un microscopio de disección colocándolo en una porción de plástico transparente y poniendo unas gotas de etanol en ella. Si la cápsula de la cabeza larval ya está separada de la exuvia, coloque una gota de glicerina en la punta de fórceps entomológicos puntiagudos y toque suavemente la cápsula de la cabeza hasta la glicerina. Coloque la cápsula de la cabeza en el tubo de microcentrífuga asociado. Si la cápsula de la cabeza todavía está unida a la exuvia larval, utilice fórceps puntiagudos y un alfiler de insectos para separar la cápsula de la cabeza de la exuvia larval. Una vez separado, utilice la técnica de glicerina para recoger la cápsula de la cabeza. Si hay demasiado etanol, puede usar una pequeña toalla de papel para eliminar algunos, pero tenga cuidado de no retirar accidentalmente la cápsula de la cabeza. Coloque la cápsula de la cabeza en un vial lleno de glicerina etiquetado y cierre bien la tapa.