تحليل متعدد النطاقات لنمو البكتيريا تحت علاج الإجهاد
Summary
يتيح هذا البروتوكول وصفا لنمو البكتيريا في ظروف الإجهاد في الخلية الواحدة ومستويات الخلايا السكانية.
Abstract
تحليل القدرة البكتيرية علي النمو والبقاء علي قيد الحياة في ظل ظروف الإجهاد أمر ضروري لمجموعه واسعه من دراسات علم الاحياء المجهرية. ومن المهم ان تميز استجابه الخلايا البكتيرية لعلاجات تحفز الإجهاد مثل التعرض للمضادات الحيوية أو غيرها من المركبات المضادة للميكروبات ، والتشعيع ، والحموضة غير الفسيولوجية ، ودرجه الحرارة ، أو تركيز الملح. قد تزعج علاجات الإجهاد المختلفة العمليات الخلوية المختلفة ، بما في ذلك انقسام الخلايا ، وتكرار الحمض النووي ، وتخليق البروتين ، وسلامه الغشاء ، أو تنظيم دوره الخلية. ترتبط هذه التاثيرات عاده بالأنماط الظاهرية المحددة علي النطاق الخلوي. ولذلك ، فان فهم مدي وسببيه النمو المستحث بالإجهاد أو أوجه القصور في القدرة علي البقاء يتطلب تحليلا دقيقا لعده بارامترات ، سواء علي صعيد الخلية الواحدة أو علي مستوي السكان. الاستراتيجية التجريبية المعروضة هنا تجمع بين رصد الكثافة البصرية التقليدية والطلاء الاختبارات مع تقنيات تحليل خليه واحده مثل تدفق الخلوي والتصوير المجهري في الوقت الحقيقي في الخلايا الحية. ويتيح هذا الإطار المتعدد المقاييس وصفا لأثر ظروف الإجهاد علي مصير السكان البكتيريين.
Introduction
الغرض العام من هذا البروتوكول هو تحليل سلوك الخلايا البكتيرية المعرضة للعلاجات الإجهاد علي السكان وعلي مستويات خليه واحده. البكتيريا النمو والقدرة علي البقاء وتعالج تقليديا علي مستوي السكان باستخدام الرصد الكثافة البصرية (OD600nm) ، والذي هو وكيل لتوليف الخلايا البكتيرية الشامل ، أو عن طريق اختبارات الطلاء لتحديد تركيز خلايا قابله للحياة في الثقافة (مستعمره تشكيل وحده في المليلتر ، كفو/مل). في ظل ظروف النمو العادية (غير المجهدة) ، يتم ربط القياسات الOD600nm و CFU/mL بدقه لان الوقت المضاعف البكتيري يعتمد مباشره علي زيادة كتله الخلية1،2. ومع ذلك ، غالبا ما تتعطل هذه العلاقة في ظل الظروف التي تؤثر علي الخلية التوليف الشامل3، خليه تقسيم4، أو ان الزناد خليه تحلل. قدمت مثال بسيطه بإجهاد معالجه ان يمنع خليه تقسيم, اي ينتج في التشكيل من خلايا جرثوميه [فيلوكمننوس]5,6. أطاله الخلايا الخيطية عاده لان التوليف الشامل للخلايا لا يتاثر ، ولكنها غير قادره علي التقسيم إلى خلايا قابله للحياة. الثقافة بصريه كثافة بالتالي سيزيد مع وقت في معدل عادية غير ان لا التركيز من خلايا قابل للحياة يحدد بطليه اختبارات ([وت]/[مل]). في هذه الحالة ، كما هو الحال في العديد من الآخرين ، والكثافة البصرية وقياسات الطلاء هي مفيده ولكنها تفشل في توفير فهم شامل للتاثير الناجم عن الإجهاد المرصود. هذه الاختبارات الفرقة تحتاج إلى الجمع بين تقنيات تحليل خليه واحده للسماح لتوصيف متعمق لنقص النمو الناجم عن الإجهاد.
ويرد هنا وصف لاجراء يجمع بين أربعه نهج تجريبية تكميليه: (1) اختبارات الطلاء التقليدية ورصد الكثافة البصرية الاساسيه لرصد قابليه الخلية للاستمرار وتوليف الخلايا علي التوالي ؛ (2) قياس التدفق الخلوي لتقييم حجم الخلية ومعلمات محتوي الحمض النووي علي اعداد كبيره من الخلايا ؛ (3) التصوير المجهري لقطه لتحليل المورفولوجية الخلية. و (4) التصوير بالخلايا الاحاديه الفاصلة زمنيا في الغرف الصغيرة لفحص الديناميكيات الزمانيه لمصير الخلية. ويسمح هذا الإطار المتعدد النطاقات بتفسير الآثار العالمية علي نمو الخلايا وقابليتها للاستمرار في ضوء سلوك الخلايا الفردية. ويمكن تطبيق هذا الاجراء علي فك الاستجابة من الأنواع البكتيرية المتنوعة لأي إجهاد تقريبا من الفائدة ، بما في ذلك النمو في ظل ظروف معينه (اي ، متوسط النمو ، الأس الهيدروجيني ، درجه الحرارة ، تركيز الملح) ، أو التعرض للمضادات الحيوية أو غيرها مركبات مضاده للميكروبات.
Protocol
Representative Results
Discussion
من الضروري ان تولي اهتماما لحاله نمو الخلايا اثناء العملية. تنمو الخلايا علي مدي عده أجيال قبل الوصول إلى مرحله الاسي الكامل. لنجاح هذه الطريقة ، من المهم ان يتم جمع جميع عينات الخلايا في وقت واحد ، وانه من الأفضل لتحليل واحد فقط المعالجة والثقافة غير المعالجة واحده في نفس الوقت. يجب الحفاظ علي عينات الخلايا للتصوير المجهري عند درجه الحرارة التجريبية طوال العملية. ومن ثم من الضروري لتسخين غرفه المجهر وغرفه ميكروفلويدريك قبل بداية التجربة. إذا كانت عينات الخلية لقياس التدفق الخلوي لا يمكن تحليلها بسهوله ، فانها يمكن ان تبقي علي الجليد لمده تصل إلى 6 ساعات. الحضانة علي الجليد سوف تحد من النمو والتحوير المورفولوجية للخلايا. بدلا من ذلك ، قد يفكر المستخدم في استخدام تثبيت الخلايا في الايثانول 75 ٪ ، والذي ينصح عاده لتدفق الخلوي10. إذا كان البروتوكول يتطلب غسل محرض الإجهاد من المتوسطة ، والطرد المركزي وخلايا ماصه بعناية فائقه لتجنب اتلاف الخلايا الشاذة المحتملة.
كل من قياس التدفق الخلوي وتحليل لقطه تعطي الوصول إلى حجم الخلية والمعلمات محتوي الحمض النووي ، مع لقطات توفير مراقبه اضافيه لمورفولوجية الخلية. تلطيخ الحمض النووي مع DAPI10 (4 ‘ ، 6-diamidino-2-فينيلانديول) أو غيرها من الاصباغ الحمض النووي مستقره يمكن ان يؤديها إذا لم يكن الانصهار الفلورية المتاحة لمراقبه النونويدات في الكائن الحي من الفائدة. إذا كان لا يمكن اجراء تحليل التدفق الخلوي ، فمن المهم ان الصورة وتحليل عدد كبير من الخلايا عن طريق المجهر.
يمكن أيضا اجراء التصوير المجهري باستخدام سلالات تحمل اندماج فلورية للبروتينات المشاركة في مسارات معينه للفائدة. وهذا من شانه ان يساعد علي الكشف عن تاثير الإجهاد علي مجموعه متنوعة من العمليات الخلوية مثل النسخ المتماثل ، والنسخ ، وتركيب جدار الخلية ، أو تقسيم الخلية. ويمكن تطبيق هذه الطريقة علي مجموعه من الأنواع البكتيرية ، والشرط الوحيد هو ان جهاز ميكروفلويدريك يجب ان تكون متوافقة مع مورفولوجية الخلايا. لوحات ميكروفلويديك القياسية هي مريحه لبكتيريا شكل قضيب مع عرض الخلية بين 0.7 μm و 4.5 μm. ومع ذلك ، cocci ، المكورات العقديه ، أو سلالات بكتيرية أخرى مع الاشكال الغريبة تحتاج إلى اختبار. بدلا من ذلك ، إذا كان لا يمكن اجراء التجارب ميكروفلوريك بسبب عدم توفر المعدات أو سلالات بكتيرية غير متوافقة ، يمكن اجراء التصوير بالفاصل الزمني علي الشرائح المثبتة علي المركبات لمده أقصاها 2 ساعة.
والميزة الشاملة لهذا التحليل متعدد النطاقات هي توفير رؤية عالميه لتاثير الضغط التعريفي علي عده جوانب من قدره النمو البكتيري (اي التوليف الشامل ، وسلامه الخلايا ، وتشكل الخلايا ، وسلامه الغشاء ، ومحتوي الحمض النووي) وطريقه هذه تتطور مع الوقت في السكان البكتيرية المتزايدة تحت ظروف الإجهاد. كما انه يسمح بتحليل استعاده النمو الطبيعي علي مستوي الخلية الواحدة ومستوي السكان. وينطبق هذا النهج علي مجموعه واسعه من الأنواع البكتيرية وعلي اي نوع من العلاج المجهد تقريبا ، مثل التعرض للمضادات الحيوية أو غيرها من المركبات المضادة للميكروبات ، وتحليل تاثير التفاعل مع الكائنات الأخرى في الأنواع المتعددة السكان ، أو تاثير الطفرة الجينية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويشكر المؤلفون f. Cornet لتوفير سلاله Hupa-mCherry , ا. ديوديو للحصول علي المساعدة التقنية مع الخلوي, و ا. ducret للحصول علي مساعده مع MicrobeJ. التمويل: c. Lesterlin يقر المؤسسات المفتوحة والCNRS وكذلك برنامج ATIP-افينير ، المؤسسة العامة للتعليم والبحث (FSER 2019) ، وتمويل ANR لبرنامج أبحاث PlasMed (ANR-CE35-0008) فضلا عن FINOVI لتمويل j. Cayron ؛ لا رابطه مكافحه السرطان لتمويل المعدات الخلوية تدفق. مساهمات المؤلف: صمم C.L. و J.C. الاجراء وكتب الورقة ؛ J.C. اجراء التجارب وتحليل البيانات.
Materials
| Agarose | BioRad | 1613100 | Certified molecular biology agarose |
| Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer | ThermoFisher scientific | A24858 | Cytometer |
| CellASIC ONIX Microfluidic System | Merck Millipore | CAX2-S0000 | Microfluidic system |
| CellASIC ONIX2 FG | Merck Millipore | ONIX2 1.0.1 | Microfluidic software |
| CellASIC ONIX2 Manifold Basic | Merck Millipore | CAX2-MBC20 | Manifold system |
| CytoOne 96-well plate with lid | Starlab | CC7672-7596 | Microplate with 0,2 mL well working volume and clear flat bottom, for automated plate reader |
| E. coli strain carrying a chromosomal insertion for a hupA-mCherry fusion | Created by P1 transduction of hupA-mCherry in E. coli MG1655 | ||
| Fiji | ImageJ | https://fiji.sc/ | Image software. Cite Schindelin et al. if used in publication |
| Gene Frame | Thermo Scientific | AB-0578 | Blue frame (125 μL, 1,7 x 2,8 cm) |
| Luria-Broth agarose medium | MP Biomedicals | 3002232 | Growth medium for plating assay |
| MicrobeJ | Imagej/Fiji plugin | https://www.microbej.com/ | Microscopy image analysis plugin. Cite Ducret et al. If used in publication; Detection settings: For bacteria : Area (μm2): 0,1-max; Length (μm): 0,5-max; Width (μm): 0,6-max; Range (μm): 0,5-max; Angularity (rad): 0-0,3; 0-max for all other parameters. For nucleoid: Tolerance: 500; Threshold: Local; 0-max for all other parameters |
| Microfluidic Plates CellASIC ONIX | Merck Millipore | B04A-03-5PK | Plate for Microfluidic system |
| Microscope Nikon eclipse Ti | Nikon | Fluorescence microscope | |
| MOPS EZ Rich Defined Medium (RDM) | Teknova | M2105 | Growth rich medium, 10x MOPS Mixture, 0,132 M K2HPO4, 10x AGCU, 5x Supplement EZ, 20% Glucose. Filtered at 0,22 μm |
| SYTO9 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain | ThermoFisher scientific | S34854 | DNA fluorescent dye |
| TECAN Infinite M1000 | TECAN | 30034301 | Automated plate reader |
References
- Donachie, W. D., Begg, K. J., Vicente, M. Cell length, cell growth and cell division. Nature. 264 (5584), 328-333 (1976).
- Donachie, W. D., Blakely, G. W. Coupling the initiation of chromosome replication to cell size in Escherichia coli. Current Opinion in Microbiology. 6 (2), 146-150 (2003).
- Patterson, D., Gillespie, D. Effect of Elevated Temperatures on Protein Synthesis in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 112 (3), 1177 (1972).
- Begg, K. J., Donachie, W. D. Cell shape and division in Escherichia coli: experiments with shape and division mutants. Journal of Bacteriology. 163 (2), 615-622 (1985).
- Van De Putte, P., Van Dillewijn, J., Roersch, A. The Selection of Mutants of Escherichia Coli with Impaired Cell Division at Elevated Temperature. Mutation Research. 106, 121-128 (1964).
- Walker, A. R. Initial characterization of temperature-sensitive cell division mutants of Escherichia coli. Biochemical and Biophysical Research Communications. 47 (5), 1074-1079 (1972).
- Lesterlin, C., Duabrry, N. Investigating Bacterial Chromosome Architecture. Chromosome Architecture. 1431, 61-72 (2016).
- Stracy, M., et al. Live-cell superresolution microscopy reveals the organization of RNA polymerase in the bacterial nucleoid. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (32), E4390-E4399 (2015).
- Fisher, J. K., et al. Four-dimensional imaging of E. coli nucleoid organization and dynamics in living cells. Cell. 153 (4), 882-895 (2013).
- Lesterlin, C., Pages, C., Dubarry, N., Dasgupta, S., Cornet, F. Asymmetry of chromosome Replichores renders the DNA translocase activity of FtsK essential for cell division and cell shape maintenance in Escherichia coli. PLoS genetics. 4 (12), e1000288 (2008).
- Schindelin, J., et al. Fiji – an Open Source platform for biological image analysis. Nature Methods. 9 (7), (2019).
- Ducret, A., Quardokus, E. M., Brun, Y. V. MicrobeJ, a tool for high throughput bacterial cell detection and quantitative analysis. Nature Microbiology. 1 (7), 16077 (2016).
- Rolinson, G. N. Effect of beta-lactam antibiotics on bacterial cell growth rate. Journal of General Microbiology. 120 (2), 317-323 (1980).
- Boye, E., Løbner-Olesen, A. Flow cytometry: illuminating microbiology. The New Biologist. 2 (2), 119-125 (1990).
- Rieseberg, M., Kasper, C., Reardon, K. F., Scheper, T. Flow cytometry in biotechnology. Applied Microbiology and Biotechnology. 56 (3-4), 350-360 (2001).
- Nolivos, S., et al. Role of AcrAB-TolC multidrug efflux pump in drug-resistance acquisition by plasmid transfer. Science. 364 (6442), 778-782 (2019).
- Chao, Y., Zhang, T. Optimization of fixation methods for observation of bacterial cell morphology and surface ultrastructures by atomic force microscopy. Applied Microbiology and Biotechnology. 92 (2), 381-392 (2011).
