Fusão célula-célula de linhas celulares editados do genoma para perturbação da estrutura celular e função

A manutenção homeostática da estrutura celular é fundamental para a vida. As células têm morfologias características, números de organelasubcelulares e composição bioquímica interna. Compreender como essas propriedades fundamentais são geradas e como elas dão errado durante a doença requer ferramentas de laboratório para perturbá-las.

A fusão celular é a fusão de duas ou mais células separadas. A fusão celular pode ter sido fundamental para o surgimento da vida eucariótica^1. No corpo humano, a fusão celular é relativamente rara, ocorrendo durante circunstâncias de desenvolvimento restritas e tipos de tecido, como durante a fertilização ou a formação de músculo, osso e a placenta^2. Este protocolo descreve a indução da fusão celular-célula em linhas celulares da cultura do tecido com organelas diferencialmente rotuladas fluorescentemente, como uma ferramenta para entender os mecanismos que controlam a estrutura e a função celular.

A fusão celular induzida in vitro é central para a produção de anticorpos monoclonais^3,uma ferramenta importante para pesquisa biológica e tratamento de doenças. A fusão celular também tem sido usada para fazer muitas perguntas biológicas de células fundamentais diferentes sobre a dominância do ciclo celular^4,aneuploide^5,6,reprogramação celular^7,8,o reparo dos neurônios danificados^9,proliferação viral¹⁰, apoptose¹¹, tumorigênese^12,dinâmica citosquelética^13,e fusão de membrana^14,15. Métodos baseados em laboratório para induzir a fusão celular-célula^16,17,18,19 induzir a coalescência da membrana lipídica através da fusão física de dois bilayers em um. A fusão celular pode ser induzida pela eletricidade^18,métodos baseados em virais^17,aquecimento termoplósma^20,expressão transgênica^19,e produtos químicos, incluindo polietileno glicol (PEG)^16,21,22.

Os centros são centros organizadores de microtúbulos que controlam a forma celular, a motilidade, a polarização e a divisão^23. Raízes centrosomal são estruturas fibrosas que se estendem de centrossomes contendo a raiz de proteína²⁴ (codificada pelo gene CROCC). Recentemente usamos a fusão celular-célula para entender como a posição e o número centrosome variam dentro dos heterokaryons em relação às células parentais^24. A lógica por trás do uso deste método é rastrear a célula de origem das raízes dentro de um heterokaryon após a fusão de células parentais diferencialmente fluorescentes marcadas e, portanto, a fusão e fissão de organela de imagem. As proteínas fluorescentemente marcadas rootletin-meGFP ou rootletin-mScarlet-I são criados pela edição do genoma em linhas celulares separadas que são então fundidos pela fusão celular peg-mediada. Descrevemos o uso de corantes celulares(Tabela de Materiais)para identificar células fundidas por citometria de fluxo e subsequente identificação de microscopia de fluorescência da célula de origem e morfologia centrosome (Figura 1). Esta abordagem é um método robusto e único para estudar como as principais mudanças no estado celular, incluindo o número organela impinge sobre a homeostase celular.