細胞構造と機能の摂動のためのゲノム編集細胞株の細胞融合

細胞構造の恒静維持は生命にとって重要である。細胞は、特徴的な形態、細胞下オルガネラ数、および内部生化学組成物を有する。これらの基本的な特性がどのように生成され、病気の間にどのように苦労するかを理解するには、それらを摂動するための実験室ツールが必要です。

細胞融合は、2つ以上の別個の細胞の融合である。細胞融合は真核生物¹の出現に重要であったかもしれない。人体において、細胞融合は比較的稀であり、受精中や筋肉、骨および胎盤²の形成中などの発達の制限された状況および組織型の間に起こる。このプロトコルは、細胞の構造および機能を制御するメカニズムを理解するツールとして、微分蛍光標識オルガネラを有する組織培養細胞株における細胞融合の誘導を記述する。

インビトロ誘導細胞融合は、モノクローナル抗体³の産生の中心であり、生物学的研究および疾患治療のための重要なツールである。細胞融合はまた、細胞周期優位性^に関する多くの異なる基本的な細胞生物学的質問を尋ねるために使用されてきた, アネプロイド^5,6, 細胞リプログラミング^7,8, 損傷ニューロンの修復⁹, ウイルス増殖¹⁰, アポトーシス¹¹, 腫瘍形成¹², サイト骨格ダイナミクス¹³, および膜融合^14,15.細胞融合16、17、18、19を誘導する実験室ベースの方法は、2つの二重層を1つに物理的に結合させることによって脂質膜合体を誘導する。細胞融合は、電気^18、ウイルスベースの方法^17、サーモプラズモン加熱^20、トランスジーン発現^19、およびポリエチレングリコール(PEG)16、21、22を含む化学物質によって誘導され得る。

セントロソームは、細胞形状、運動性、偏光、および分裂²³を制御する微小管組織化センターである。心分離根は、タンパク質ルートレットイン²⁴を含むセントロソーム(遺伝子CROCCによってコードされる)から延びる線維構造である。我々は最近、細胞融合を用いて、親細胞²⁴に対するヘテロコン内の重心の位置と数がどのように変化するかを理解した。この方法の使用の背後にある根拠は、微分蛍光タグ付き親細胞の融合後にヘテロカリオン内の根の起源の細胞を追跡し、したがって、オルガネラ融合と核分裂を画像化することです。蛍光タグ付きタンパク質のルートレチン-meGFPまたはルートレチン-mScarlet-Iは、PEG媒介細胞融合によって融合された別々の細胞株でゲノム編集によって作成されます。細胞染色体(材料表)を用いて、フローサイトメトリーおよびその後の蛍光顕微鏡による起源および形態のセントロソーム細胞の同定によって融合細胞を同定する(図1)。このアプローチは、オルガネラ数を含む細胞状態の大きな変化が細胞恒常性にどのように影響するかを研究するための堅牢でユニークな方法です。