خلايا خليه الانصهار من الجينوم تحرير خطوط الخلايا لاضطراب الهيكل الخلوي والوظيفة
Summary
الغرض من هذا البروتوكول هو دمج نوعين مختلفين من الخلايا لإنشاء خلايا مختلطة. يستخدم تحليل المجهر الفلوري للخلايا المنصهرة لتتبع الخلية الاصليه للعضيات الخلوية. يمكن استخدام هذا الفحص لاستكشاف كيفيه استجابه البنية الخلوية والوظيفة للاضطراب بواسطة دمج الخلايا.
Abstract
الحياة مقسمه مكانيا داخل اغشيه الدهن للسماح بالتشكيل المعزول للدول الجزيئية المتميزة داخل الخلايا والأرغن. دمج الخلايا هو دمج خليتين أو أكثر لتشكيل خليه واحده. هنا نقدم بروتوكولا لدمج الخلايا من نوعين مختلفين من الخلايا. يتم إثراء الخلايا الهجينة تنصهر عن طريق الفرز القائم علي التدفق الخلوي ، تليها المجهر الفلوري من بنيه الخلية الهجينة وظيفة. فلوريسسينتلي الموسومة البروتينات المتولدة عن الجينوم التحرير هي الذين تتراوح أعمارهم داخل الخلايا تنصهر ، مما يسمح الهياكل الخلوية ليتم تحديدها علي أساس الانبعاثات فلوري والمشار اليها مره أخرى إلى نوع الخلية من أصل. ويمكن تطبيق هذه الطريقة القوية والعامة علي أنواع مختلفه من الخلايا أو العضيات من الفائدة ، لفهم بنيه الخلوية ووظيفتها عبر مجموعه من المسائل البيولوجية الاساسيه.
Introduction
الصيانة الساكنة للهيكل الخلوي أمر بالغ الاهميه للحياة. الخلايا لها مورفولوجيس المميزة ، والأرقام العضوية الفرعية الخلوية ، والتركيب البيوكيميائي الداخلي. فهم كيف يتم إنشاء هذه الخصائص الاساسيه وكيف انها تذهب منحرف اثناء المرض يتطلب أدوات مختبريه للاضطراب لهم.
انصهار الخلية هو دمج خليتين منفصلتين أو أكثر. قد يكون الانصهار الخلية الحاسمة لظهور حياه حقيقية النواة1. في جسم الإنسان ، والانصهار الخلية نادره نسبيا ، والتي تحدث خلال الظروف التنموية المقيدة وأنواع الانسجه ، مثل اثناء الإخصاب أو تشكيل العضلات والعظام والمشيمة2. يصف هذا البروتوكول الحث علي دمج خلايا الخلايا في خطوط خلايا ثقافة الانسجه مع الفلوريسسينتلي المسمية بشكل مختلف ، كاداه لفهم أليات التي تتحكم في بنيه الخلية ووظيفتها.
في المختبر المستحث خليه خليه الانصهار هو المركزي لإنتاج الأجسام المضادة الاحاديه3, أداه هامه للبحوث البيولوجية وعلاج الامراض. وقد استخدمت الخلية الانصهار أيضا لطرح العديد من الاسئله الحيوية المختلفة الخلية الاساسيه حول الهيمنة دوره الخلية4, انوبلويدي5,6, أعاده برمجه الخلوية7,8, إصلاح الخلايا العصبية التالفة9, انتشار الفيروسية10, موت الخلايا11, توتوريجينيسيس12 الأساليب المختبرية للحث علي خليه خليه الانصهار16،17،18،19 للحث علي التحام غشاء الدهن من خلال الدمج المادي لاثنين من البليرس في واحد. يمكن ان يسببها الانصهار الخلية بواسطة الكهرباء18، الفيروسية الطرق القائمة17، التدفئة الحرارية20، التعبير عبر الجينات19، والمواد الكيميائية بما في ذلك البولي إيثيلين غليكول (PEG)16،21،22.
سينتسوميس هي مراكز تنظيم المجهرية التي تتحكم في الشكل الخلوي ، والحركية ، والاستقطاب ، والقسمة23. جذور سينتسوال هي الهياكل الليفية التي تمتد من سينتسوميس التي تحتوي علي بروتين روتليتين24 (المشفرة من قبل الجينات crocc). وقد استخدمنا في الاونه الاخيره خلايا الخلية الانصهار لفهم كيف سينتريبعض الموقف وعدد يختلف داخل الاختلافات بالنسبة للخلايا الابويه24. الأساس المنطقي وراء استخدام هذه الطريقة هو لتتبع خليه المنشا من جذور داخل مغاير بعد الانصهار من فلوريسسينتلي بشكل مختلف الموسومة الخلايا الابويه ، التالي إلى صوره عضيه الانصهار والانشطار. فلوريسسينتلي الموسومة البروتينات روتليتين أو روتليتين يتم إنشاؤها بواسطة الجينوم التحرير في خطوط الخلايا منفصلة والتي تنصهر بعد ذلك عن طريق الربط بوساطة الخلية الانصهار. ونحن نقدم وصفا لاستخدام الاصباغ الخلوية (جدول المواد) لتحديد الخلايا المنصهرة من خلال القياس الخلوي للتدفق والتحديد المجهري اللاحق لخليه المنشا والتشكل (الشكل 1). هذا النهج هو وسيله قويه وفريدة من نوعها لدراسة كيفيه التغييرات الرئيسية في الدولة الخلوية بما في ذلك عدد عضيه يمس التوازن الخلية.
Protocol
Representative Results
Discussion
ونحن نظهر بروتوكولا سهل الاستخدام وفعالا من حيث التكلفة لدمج الخلايا وتصور البنية اللاحقة للخلايا الهجينة مع المجهر ، مع أخذ ما يقرب من يومين من البداية إلى النهاية. والأجزاء الهامه من هذا البروتوكول هي إثراء الخلايا المنصهرة حسب فرز الخلايا (القسم 3 من البروتوكول) ، والتحقق الدقيق من الخ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل زمالة هنري ويلكوم الاستئمانية لR.M. (https://wellcome.ac.uk/grant number 100090/12/Z). ولم يكن لهذا الممول اي دور في تصميم الدراسة ، وجمع البيانات وتحليلها ، واتخاذ قرار بنشر المخطوطة أو اعدادها. نشكر أشوك فينكيارامان وبول الفرنسية علي المشورة النقدية والتوجيه بشان المشروع. نشكر كيارا كوستيستي وغابرييلا غروندريس-كواربه في معهد كامبردج للبحوث الطبية التدفق الخلوي المرفق للحصول علي دعم ممتاز. نشكر ليام كاسيداي ، توماس ميلر ، وججيانماركو كونتيو لتصحيح المخطوطة.
Materials
| 15 ml tube | Sarstedt | 62554502 | |
| 37% formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | F8875 | |
| 880 Laser Scanning Confocal Airyscan Microscope | Carl Zeiss | ||
| 8-well imaging dishes | Ibidi | 80826 | |
| Anti-GFP alpaca GFP booster nanobody | Chromotek | gba-488 | |
| BD Influx Cell Sorter | BD Biosciences | ||
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cell Filters (70um) | Biofil | CSS010070 | |
| CellTrace Far Red | ThermoFisher Scientific | C34572 | |
| CellTrace Violet | ThermoFisher Scientific | C34571 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX, pyruvate | ThermoFisher Scientific | 31966021 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 10270-106 | |
| FluoTag-X2 anti-mScarlet-I alpaca nanobody | NanoTag Biotechnologies | N1302-At565 | |
| L15 CO2 independent imaging medium | Sigma-Aldrich | 21083027 | |
| Penicillin/streptomycin | Sigma-Aldrich | 15140122 | |
| Phenol red free DMEM, high glucose | ThermoFisher Scientific | 21063029 | |
| Phosphate buffered saline (1 x PBS) | 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2HPO4, dH2O up to 1L | ||
| Polyethylene Glycol Hybri-Max 1450 | Sigma-Aldrich | P7181 | |
| Polypropylene tubes | BD Falcon | 352063 | |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151 | nonionic surfactant |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| Tween 20 | Fisher BioReagents | BP337 | nonionic detergent |
References
- Lane, N. . Power, Sex, Suicide: Mitochondria and the meaning of life. , (2006).
- Brukman, N. G., Uygur, B., Podbilewicz, B., Chernomordik, L. V. How cells fuse. The Journal of Cell Biology. 218 (5), 1436-1451 (2019).
- Köhler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).
- Rao, P. N., Johnson, R. T. Mammalian Cell Fusion: Studies on the Regulation of DNA Synthesis and Mitosis. Nature. 225 (5228), 159-164 (1970).
- Lengauer, C., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. Genetic instability in colorectal cancers. Nature. 386 (6625), 623-627 (1997).
- Fournier, R. E., Ruddle, F. H. Microcell-mediated transfer of murine chromosomes into mouse, Chinese hamster, and human somatic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (1), 319-323 (1977).
- Tada, M., Tada, T., Lefebvre, L., Barton, S. C., Surani, M. A. Embryonic germ cells induce epigenetic reprogramming of somatic nucleus in hybrid cells. The EMBO Journal. 16 (21), 6510-6520 (1997).
- Skelley, A. M., Kirak, O., Suh, H., Jaenisch, R., Voldman, J. Microfluidic control of cell pairing and fusion. Nature Methods. 6 (2), 147-152 (2009).
- Donaldson, J., Shi, R., Borgens, R. Polyethylene glycol rapidly restores physiological functions in damaged sciatic nerves of guinea pigs. Neurosurgery. 50 (1), 147-157 (2002).
- Duelli, D. M., Hearn, S., Myers, M. P., Lazebnik, Y. A primate virus generates transformed human cells by fusion. The Journal of Cell Biology. 171 (3), 493-503 (2005).
- Duelli, D. M., Lazebnik, Y. A. Primary cells suppress oncogene-dependent apoptosis. Nature Cell Biology. 2 (11), 859-862 (2000).
- Duelli, D. M., et al. A virus causes cancer by inducing massive chromosomal instability through cell fusion. Current Biology. 17 (5), 431-437 (2007).
- Paramio, J. M., Casanova, M. L., Alonso, A., Jorcano, J. L. Keratin intermediate filament dynamics in cell heterokaryons reveals diverse behaviour of different keratins. Journal of Cell Science. 110, 1099-1111 (1997).
- Lentz, B. R. PEG as a tool to gain insight into membrane fusion. European Biophysics Journal. 36 (4-5), 315-326 (2007).
- Lentz, B. R., Lee, J. K. Poly(ethylene glycol) (PEG)-mediated fusion between pure lipid bilayers: a mechanism in common with viral fusion and secretory vesicle release?. Molecular Membrane Biology. 16 (4), 279-296 (1999).
- Pontecorvo, G. Production of mammalian somatic cell hybrids by means of polyethylene glycol treatment. Somatic Cell Genetics. 1 (4), 397-400 (1975).
- Okada, Y. Analysis of giant polynuclear cell formation caused by HVJ virus from Ehrlich’s ascites tumor cells. I. Microscopic observation of giant polynuclear cell formation. Experimental Cell Research. 26, 98-107 (1962).
- Zimmermann, U. Electric field-mediated fusion and related electrical phenomena. Biochimica et Biophysica Acta. 694 (3), 227-277 (1982).
- Hu, C., et al. Fusion of cells by flipped SNAREs. Science. 300 (5626), 1745-1749 (2003).
- Bahadori, A., Lund, A. R., Semsey, S., Oddershede, L. B., Bendix, P. M. Controlled cellular fusion using optically trapped plasmonic nano-heaters. Optical Trapping and Optical Micromanipulation XIII. 9922, 992211 (2016).
- Kao, K. N., Michayluk, M. R. A method for high-frequency intergeneric fusion of plant protoplasts. Planta. 115 (4), 355-367 (1974).
- Ahkong, Q. F., Fisher, D., Tampion, W., Lucy, J. A. Mechanisms of cell fusion. Nature. 253 (5488), 194-195 (1975).
- Mahen, R., Venkitaraman, A. R. Pattern formation in centrosome assembly. Current Opinion in Cell Biology. 24 (1), 14-23 (2012).
- Mahen, R. Stable centrosomal roots disentangle to allow interphase centriole independence. PLoS Biology. 16 (4), e2003998 (2018).
- Mahen, R., et al. Comparative assessment of fluorescent transgene methods for quantitative imaging in human cells. Molecular Biology of the Cell. 25 (22), 3610-3618 (2014).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Yang, J., Shen, M. H. Polyethylene glycol-mediated cell fusion. Methods in Molecular Biology. 325, 59-66 (2006).
- Huang, L., Chen, Y., Huang, W., Wu, H. Cell pairing and polyethylene glycol (PEG)-mediated cell fusion using two-step centrifugation-assisted single-cell trapping (CAScT). Lab on a Chip. 18 (7), 1113-1120 (2018).
- Feliciano, D., Nixon-Abell, J., Lippincott-Schwartz, J. Triggered Cell-Cell Fusion Assay for Cytoplasmic and Organelle Intermixing Studies. Current Protocols in Cell Biology. 81 (1), e61 (2018).
- Vaughan, V. L., Hansen, D., Stadler, J. Parameters of polyethylene glycol-induced cell fusion and hybridization in lymphoid cell lines. Somatic Cell Genetics. 2 (6), 537-544 (1976).
- Frye, L. D., Edidin, M. The rapid intermixing of cell surface antigens after formation of mouse-human heterokaryons. Journal of Cell Science. 7 (2), 319-335 (1970).
- Mattenberger, Y., James, D. I., Martinou, J. C. Fusion of mitochondria in mammalian cells is dependent on the mitochondrial inner membrane potential and independent of microtubules or actin. FEBS Letters. 538 (1-3), 53-59 (2003).
- Kerbel, R. S., Lagarde, A. E., Dennis, J. W., Donaghue, T. P. Spontaneous fusion in vivo between normal host and tumor cells: possible contribution to tumor progression and metastasis studied with a lectin-resistant mutant tumor. Molecular and Cellular Biology. 3 (4), 523-538 (1983).
