ניתוח הובלה מיטוכונדריאלי ומורפולוגיה בתאי גזע בעלי השפעה של האדם המושרה בנוירונים
Summary
הובלה מיטוכונדריאלי לקויה ומורפולוגיה מעורבים במחלות ניווניות שונות. הפרוטוקול המוצג משתמש מושרה המושרה תא גזע הנגזרת הנוירונים המוח כדי להעריך הובלה מיטוכונדריאלי ומורפולוגיה ב מפרסטית תורשתית. פרוטוקול זה מאפשר אפיון של סחר מיטוכונדריאלי לאורך אקסונים וניתוח של מורפולוגיה שלהם, אשר להקל על המחקר של מחלות ניווניות.
Abstract
נוירונים יש דרישות אינטנסיבי לאנרגיה גבוהה על מנת לתמוך בתפקודים שלהם. לקויי הובלה מיטוכונדריאלי לאורך אקסונים נצפתה בנוירונים אנושיים, אשר עשויים לתרום נוירוניוון במצבי מחלה שונים. למרות שהוא מאתגר לבחון דינמיקה מיטוכונדריאלי בעצבים אנושיים חיים, תפיסות כאלה הן קריטיות ללימוד התפקיד של המיטו, בניוון שחור. המתואר כאן הוא פרוטוקול לניתוח הובלה מיטוכונדריאלי ומורפולוגיה מיטוכונדריאלי בתאי המוח המוחזקים שמקורם האדם המושרה pluripotent תאים גזע (. IPSCs מובחנים לתוך הנוירונים telencephalic glutamatergic באמצעות שיטות מבוססות היטב. המיטוטור של הנוירונים מוכתם עם MitoTracker CMXRos, ותנועה מיטוכונדריאלי בתוך האקסונים נלכדים באמצעות מיקרוסקופ לחיות הדמיה מצויד בחממה לתרבות התא. תמונות בזמן קפיצה מנותח באמצעות תוכנה עם “MultiKymograph”, “היבואן Bioformat”, ו “מאקרו” תוספים. הקייגרפים של תחבורה מיטוכונדריאלי מופקים, ומהירות מיטוכונדריאלי ממוצעת בכיוונים המודרכים והנסיגה מקריאה מהקימוגרף. בנוגע לניתוח מורפולוגיה מיטוכונדריאלי, אורך מיטוכונדריאלי, אזור ויחס גובה-רוחב מתקבלים באמצעות ImageJ. לסיכום, פרוטוקול זה מאפשר אפיון של סחר מיטוכונדריאלי לאורך אקסונים וניתוח של המבנה שלהם כדי להקל על מחקרים של מחלות ניווניות.
Introduction
תנועתיות מיטוכונדריאלי והפצה ממלאים תפקיד חיוני במילוי הדרישות האנרגטיות המיוחדות בנוירונים מקוטטים. נוירונים יכולים להאריך אקסונים ארוכים מאוד כדי להתחבר עם מטרות דרך היווצרות של הסינפסות, אשר דורשים רמות גבוהות של אנרגיה עבור Ca2 + אגירה וזרמים יון. תחבורה של המיטו, מ סומה כדי אקסון הוא קריטי לתמיכה בתפקוד אקסון ו סינפטית של נוירונים. התנועה מיטוכונדריאלי דינמי באופן זמני מתנהל על ידי הובלה סיבי מהירה בשיעורי מיקרומטר מספר1לשנייה.
במיוחד, חלבונים מוטוריים או מתאם, כגון קינזין ו dynein, להשתתף בתחבורה ארגונית מהירה לאורך microtubules לשלוט על התנועה שלהמיטומטר 2,3. פעילות עצבית נורמלית דורשת העברה נאותה של המיטו, החדשים מתוך הנוירואליות החדשה (הובלה אקסון) והעברה הפוכה של המיטוטרים מן המרוחק בחזרה אל גוף התא (הובלה רטרוגרדית). מחקרים שנעשו לאחרונה ציינו כי הקצאת מיטוכונדריאלי לא ראויה קשורה בחוזקה עם פגמים עצביים ומחלות ניווניות תא מנוע4,5. לכן, כדי לנתח את התפקיד של המיטו, בניוון נוירולוגי, חשוב להקים שיטות לבדיקת תנועה מיטוכונדריאלי לאורך האקסונים בתרבויות חיות.
ישנם שני אתגרים עיקריים בבדיקת וניתוח מעקב אחר המיטו, (1) זיהוי המיטוטרים מהרקע בכל מסגרת, ו (2) ניתוח ויצירת הקשרים בין כל מסגרת. בפתרון האתגר הראשון, גישה תיוג פלואורסצנטית משמש באופן נרחב כדי להבחין המיטומטר מן הרקע, כגון מיטואו לצבוע או העברה של מיטוכונדריזה של התמזגו פלואורסצנטי (למשל, mito-gfp)6,7,8. לניתוח הקשר בין מסגרות, מספר אלגוריתמים וכלי תוכנה תוארו במחקרים קודמים9. בעיתון האחרון, החוקרים לעומת ארבעה כלים אוטומטיים שונים (למשל, Volocity, Imaris אריס, wrMTrck, וההבדל עוקב) כדי לכמת הובלה מיטוכונדריאלי. התוצאות הראו כי למרות אי-התאמות באורך המסלול, העקירה מיטוכונדריאלי, משך התנועה, ומהירות, אלה כלים אוטומטיים מתאימים להערכת הפרשי התחבורה לאחר הטיפול10. בנוסף לכלים אלה, תוסף משולב “מאקרו” עבור ImageJ (נכתב על ידי Rietdorf ו-Seitz) נעשה שימוש נרחב לניתוח הובלה מיטוכונדריאלי11. שיטה זו מייצרת קימוגרפים שניתן להשתמש בהם לניתוח תנועה מיטוכונדריאלי, כולל מהירות בכיוונים כוללים וכיווני נסיגה.
מיטוכונמיטוa הם אורגלות דינמיות ביותר, שמשתנים באופן קבוע במספר ובמבנה מתוך תגובה לתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים. ביקוע מיטוכונדריאלי והיתוך בחוזקה להסדיר מורפולוגיה והומאוסטזיס. חוסר האיזון בין ביקוע מיטוכונדריאלי ופיוז’ן יכול לגרום לרשתות מיטוכונדריאליות קצרות או ארוכות במיוחד, שיכולות לפגוע בתפקוד מיטוכונדריאלי ולגרום לפעילות עצבית חריגה וניוון עצבי. הובלה מיטוכונדריאלי לקויה ומורפולוגיה מעורבים במחלות ניווניות שונות, כגון מחלת אלצהיימר, מחלת פרקינסון, מחלת הנטינגטון, ו מצנח העיוותים תורשתי (hsp)12,13,14,15. Hsp היא קבוצה הטרוגנית של הפרעות נוירולוגיות תורשתית המאופיינת הניוון של corticospinal בדרכי והכשל הבאים לשלוט שרירי הגפיים התחתונות16,17. במחקר זה, הנוירונים הנגזרות iPSC מראש משמשים להערכת הובלה מיטוכונדריאלי מורפולוגיה ב HSP. שיטה זו מספקת פרדיגמה ייחודית לבדיקת דינמיקה מיטוכונדריאלי של האקאונים העצביים בתרבויות חיות.
Protocol
Representative Results
Discussion
מאמר זה מתאר שיטה לניתוח הובלה מיטוכונדריאלי ומורפולוגיה בדפוס עצבי באמצעות צבע פלורסנט אדום ותוכנת imagej, שניהם מספקים פלטפורמה ייחודית לחקר ניוון אקסונים ומורפולוגיה מיטוכונדרילית במחלות ניווניות. קיימים מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול, כולל כתמים של המיטו, הדמיה של תאים חיים וניתוח התמו?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
העבודה הזאת נתמכת על ידי הקרן הפרספסטית, קרן בלייזר ו-NIH (R21NS109837).
Materials
| Accutase Cell Detachment Solution | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| Biosafety hood | Thermo Scientific | 1300 SERIES A2 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A-7906 | |
| Brain derived neurotrophic factor (BDNF) | Peprotech | 450-02 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall Legend X1R/ 75004261 | |
| Coverslips | Chemiglass Life Sciences | 1760-012 | |
| Cyclic AMP (cAMP) | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | |
| Dorsomorphin | Selleckchem | S7146 | |
| Dulbecco's modified eagle medium with F12 nutrient mixture (DMEM/F12) | Corning | 10-092-CV | |
| FBS | Gibco | 16141-002 | |
| Fibroblast growth factor 2 (FGF2, bFGF) | Peprotech | 100-18B | |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Gibco | A1413201 | |
| Gem21 NeuroPlex Serum-Free Supplement | Gemini | 400-160 | |
| Glass Bottom Dishes | MatTek | P35G-0.170-14-C | |
| 9'' glass pipetes | VWR | 14673-043 | |
| Glial derived neurotrophic factor (BDNF) | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| GlutaMAX-I | Gibco | 35050-061 | |
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| Insulin growth factor 1 (IGF1) | Invitrogen | M7512 | |
| Knockout Serum Replacer | Gibco | A31815 | |
| Laminin | Sigma | L-6274 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148-100ML | |
| MitoTracker CMXRos | Invitrogen | M7512 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| Non Essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | |
| N2 NeuroPle Serum-Free Supplement | Gemini | 400-163 | |
| Olympus microscope IX83 | Olympus | IX83-ZDC2 | |
| PBS | Corning | 21-031-CV | |
| Phase contrast microscope | Olympus | CKX41/ IX2-SLP | |
| 6 well plates | Corning | 353046 | |
| 24 well plates | Corning | 353047 | |
| Poly-L-ornithine hydrobromide (polyornithine)) | Sigma-Aldrich | P3655 | |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010 | |
| Sterile 50ml Disposable Vacuum Filtration System 0.22 μm Millipore Express® Plus Membrane | Millipore | SCGP00525 | |
| Stericup 500/1000 ml Durapore 0.22 μM PVDF | Millipore | SCGVU10RE | |
| Tbr1 antibody (1:2000) | Chemicon | AB9616 | |
| Trypsin inhibitor | Gibco | 17075029 | |
| 50 ml tubes | Phenix | SS-PH50R | |
| 15 ml tubes | Phenix | SS-PH15R | |
| T25 flasks (untreated) | VWR | 10861-572 | |
| Plugins for softwares | |||
| Bio-formats Package | http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/5.1.0/ | ||
| Fiji software | https://fiji.sc/ | ||
| Kymograph Plugin | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| MultipleKymograph.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| MultipleOverlay.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| WalkingAverage.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| StackDifference.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| Straighten_.jar | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/straighten.html | ||
| tsp050706.txt | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html |
References
- Brown, A. Axonal transport of membranous and nonmembranous cargoes: a unified perspective. Journal of Cell Biology. 160 (6), 817-821 (2003).
- Morris, R. L., Hollenbeck, P. J. Axonal transport of mitochondria along microtubules and F-actin in living vertebrate neurons. The Journal of Cell Biology. 131 (5), 1315-1326 (1995).
- Schwarz, T. L. Mitochondrial trafficking in neurons. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (6), (2013).
- Magrane, J., Cortez, C., Gan, W. B., Manfredi, G. Abnormal mitochondrial transport and morphology are common pathological denominators in SOD1 and TDP43 ALS mouse models. Human Molecular Genetics. 23 (6), 1413-1424 (2014).
- Alami, N. H., et al. Axonal transport of TDP-43 mRNA granules is impaired by ALS-causing mutations. Neuron. 81 (3), 536-543 (2014).
- Wang, X., Schwarz, T. L. Imaging axonal transport of mitochondria. Methods in Enzymology. 457, 319-333 (2009).
- Course, M. M., et al. Live Imaging Mitochondrial Transport in Neurons. Neuromethods. 123, 49-66 (2017).
- Chazotte, B. Labeling mitochondria with fluorescent dyes for imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (6), 4948 (2009).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
- Bros, H., Hauser, A., Paul, F., Niesner, R., Infante-Duarte, C. Assessing Mitochondrial Movement Within Neurons: Manual Versus Automated Tracking Methods. Traffic. 16 (8), 906-917 (2015).
- Calkins, M. J., Manczak, M., Mao, P., Shirendeb, U., Reddy, P. H. Impaired mitochondrial biogenesis, defective axonal transport of mitochondria, abnormal mitochondrial dynamics and synaptic degeneration in a mouse model of Alzheimer’s disease. Human Molecular Genetics. 20 (23), 4515-4529 (2011).
- Denton, K., et al. Impaired mitochondrial dynamics underlie axonal defects in hereditary spastic paraplegias. Human Molecular Genetics. 27 (14), 2517-2530 (2018).
- Kim-Han, J. S., Antenor-Dorsey, J. A., O’Malley, K. L. The parkinsonian mimetic, MPP+, specifically impairs mitochondrial transport in dopamine axons. Journal of Neuroscience. 31 (19), 7212-7221 (2011).
- Shirendeb, U. P., et al. Mutant huntingtin’s interaction with mitochondrial protein Drp1 impairs mitochondrial biogenesis and causes defective axonal transport and synaptic degeneration in Huntington’s disease. Human Molecular Genetics. 21 (2), 406-420 (2012).
- Lo Giudice, T., Lombardi, F., Santorelli, F. M., Kawarai, T., Orlacchio, A. Hereditary spastic paraplegia: clinical-genetic characteristics and evolving molecular mechanisms. Experimental Neurology. 261, 518-539 (2014).
- Blackstone, C. Cellular pathways of hereditary spastic paraplegia. Annual Review of Neuroscience. 35, 25-47 (2012).
- Boisvert, E. M., Denton, K., Lei, L., Li, X. J. The specification of telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments. (74), e50321 (2013).
- Zhu, P. P., Denton, K. R., Pierson, T. M., Li, X. J., Blackstone, C. Pharmacologic rescue of axon growth defects in a human iPSC model of hereditary spastic paraplegia SPG3A. Human Molecular Genetics. 23 (21), 5638-5648 (2014).
- Marra, M. H., Tobias, Z. J., Cohen, H. R., Glover, G., Weissman, T. A. In Vivo Time-Lapse Imaging in the Zebrafish Lateral Line: A Flexible, Open-Ended Research Project for an Undergraduate Neurobiology Laboratory Course. Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 13 (3), 215-224 (2015).
- Kang, J. S., et al. Docking of axonal mitochondria by syntaphilin controls their mobility and affects short-term facilitation. Cell. 132 (1), 137-148 (2008).
- Mou, Y., Li, X. J. Rescue axonal defects by targeting mitochondrial dynamics in hereditary spastic paraplegias. Neural Regeneration Research. 14 (4), 574-577 (2019).
- Huang, S., et al. New photostable naphthalimide-based fluorescent probe for mitochondrial imaging and tracking. Biosensors & Bioelectronics. 71, 313-321 (2015).
- Carvalho, P. H., et al. Designed benzothiadiazole fluorophores for selective mitochondrial imaging and dynamics. Chemistry. 20 (47), 15360-15374 (2014).
- Yamakoshi, H., et al. A sensitive and specific Raman probe based on bisarylbutadiyne for live cell imaging of mitochondria. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 25 (3), 664-667 (2015).
- Neumann, S., Chassefeyre, R., Campbell, G. E., Encalada, S. E. KymoAnalyzer: a software tool for the quantitative analysis of intracellular transport in neurons. Traffic. 18 (1), 71-88 (2017).
- Chen, M., et al. A new method for quantifying mitochondrial axonal transport. Protein & Cell. 7 (11), 804-819 (2016).
- De Vos, K. J., Sheetz, M. P. Visualization and quantification of mitochondrial dynamics in living animal cells. Methods in Cell Biology. 80, 627-682 (2007).
- Denton, K. R., Xu, C. C., Li, X. J. Modeling Axonal Phenotypes with Human Pluripotent Stem Cells. Methods in Molecular Biology. 1353, 309-321 (2016).
- Andrews, S., Gilley, J., Coleman, M. P. Difference Tracker: ImageJ plugins for fully automated analysis of multiple axonal transport parameters. Journal of Neuroscience Methods. 193 (2), 281-287 (2010).
- Reis, G. F., et al. Molecular motor function in axonal transport in vivo probed by genetic and computational analysis in Drosophila. Molecular Biology of the Cell. 23 (9), 1700-1714 (2012).
- Broeke, J. H., et al. Automated quantification of cellular traffic in living cells. Journal of Neuroscience Methods. 178 (2), 378-384 (2009).
- Welzel, O., Knorr, J., Stroebel, A. M., Kornhuber, J., Groemer, T. W. A fast and robust method for automated analysis of axonal transport. European Biophysics Journal : EBJ. 40 (9), 1061-1069 (2011).
- Mukherjee, A., et al. Automated kymograph analysis for profiling axonal transport of secretory granules. Medical Image Analysis. 15 (3), 354-367 (2011).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays monitoring autophagy. Autophagy. 12, 1 (2016).
- Metivier, D., et al. Cytofluorometric detection of mitochondrial alterations in early CD95/Fas/APO-1-triggered apoptosis of Jurkat T lymphoma cells. Comparison of seven mitochondrion-specific fluorochromes. Immunology Letters. 61 (2-3), 157-163 (1998).
- Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives. Biophysical Journal. 76, 469-477 (1999).
- Liu, X., Yang, L., Long, Q., Weaver, D., Hajnoczky, G. Choosing proper fluorescent dyes, proteins, and imaging techniques to study mitochondrial dynamics in mammalian cells. Biophysics Reports. 3 (4), 64-72 (2017).
- Zhou, B., Lin, M. Y., Sun, T., Knight, A. L., Sheng, Z. H. Characterization of mitochondrial transport in neurons. Methods in Enzymology. 547, 75-96 (2014).
