تحليل نقل الميتوكوندريا ومورفولوجيا في الخلايا العصبية الجذعية المستحثة البشرية متعددة القدرات المشتقة من الخلايا الجذعية في الشلل النصفي التشنجي الوراثي
Summary
ويشارك ضعف نقل الميتوكوندريا ومورفولوجيا في مختلف الأمراض العصبية التنكسية. يستخدم البروتوكول المقدم الخلايا العصبية الجذعية المشتقة من الخلايا الجذعية المستحثة لتقييم نقل الميتوكوندريا والمورفولوجيا في الشلل النصفي التشنجي الوراثي. يسمح هذا البروتوكول بتوصيف الاتجار بالميتوكوندريا على طول المحاور وتحليل مورفولوجيا ها ، مما سيسهل دراسة الأمراض العصبية.
Abstract
الخلايا العصبية لديها مطالب مكثفة للحصول على طاقة عالية من أجل دعم وظائفها. وقد لوحظ ضعف نقل الميتوكوندريا على طول محاور عصبية في الخلايا العصبية البشرية, التي قد تسهم في التنكس العصبي في مختلف الدول المرض. على الرغم من أنه من الصعب دراسة ديناميات الميتوكوندريا في الأعصاب البشرية الحية ، فإن مثل هذه النماذج حاسمة لدراسة دور الميتوكوندريا في التنكس العصبي. وصف هنا هو بروتوكول لتحليل نقل الميتوكوندريا ومورفولوجيا الميتوكوندريا في محاور عصبية الدماغ الأمامية المستمدة من الخلايا الجذعية المستحثة الإنسان (iPSCs). يتم تمييز iPSCs إلى الخلايا العصبية الجلوتامات telencephalic باستخدام أساليب راسخة. يتم تلطيخ الميتوكوندريا من الخلايا العصبية مع MITOTracker CMXRos، ويتم التقاط حركة الميتوكوندريا داخل محاور عصبية باستخدام مجهر التصوير الخلية الحية مجهزة حاضنة لثقافة الخلايا. يتم تحليل الصور الفاصلة الزمنية باستخدام البرامج مع “MultiKymograph” ، “المستورد Bioformat” ، والإضافات “وحدات الماكرو”. يتم إنشاء Kymographs النقل الميتوكوندريا، ويتم قراءة متوسط سرعة الميتوكوندريا في الاتجاهات الانتريوية وإلى الوراء من الكيموغراف. فيما يتعلق بتحليل مورفولوجيا الميتوكوندريا ، يتم الحصول على طول الميتوكوندريا والمنطقة ونسبة العرض إلى الارتفاع باستخدام ImageJ. وباختصار، يسمح هذا البروتوكول بتوصيف الاتجار بالميتوكوندريا على طول محاور عصبية وتحليل مورفولوجيا ها لتسهيل دراسات الأمراض العصبية.
Introduction
تلعب الحركة التوزيعية الميتوكوندريا دورًا حيويًا في تلبية المطالب النشطة المتغيرة والمتخصصة في الخلايا العصبية المستقطبة. الخلايا العصبية يمكن أن تمتد محاور طويلة للغاية للتواصل مع الأهداف من خلال تشكيل نقاط الاشتباك العصبي، والتي تتطلب مستويات عالية من الطاقة لكاليفورنيا2 + التخزين المؤقت والتيارات الأيون. نقل الميتوكوندريا من سوما إلى محور عصبي أمر بالغ الأهمية لدعم وظيفة المحاور العصبية ومتشابك من الخلايا العصبية. يتم إجراء حركة الميتوكوندريا الديناميكية مكانيًا وزمنيًا عن طريق النقل المحوري السريع بمعدلات عدة ميكرومترات في الثانية1.
على وجه التحديد، البروتينات الحركية أو المحولة، مثل kinesin وdynein، والمشاركة في النقل العضي السريع على طول microtubules للسيطرة على حركة الميتوكوندريا2،3. يتطلب النشاط العصبي العادي النقل السليم للميتوكوندريا المجمعة حديثًا من سوما الخلايا العصبية إلى محور عصبي بعيد (النقل المحوري الأنتري) والنقل العكسي للميتوكوندريا من محور عصبي بعيد إلى جسم الخلية (النقل الرجعي). وقد أشارت الدراسات الحديثة إلى أن تخصيص الميتوكوندريا غير لائق يرتبط بقوة مع عيوب الخلايا العصبية والأمراض التنكسية الخلايا العصبية الحركية4,5. لذلك ، لتشريح دور الميتوكوندريا في التنكس العصبي ، من المهم إنشاء طرق لفحص حركة الميتوكوندريا على طول المحاور في الثقافات الحية.
هناك تحديان رئيسيان في فحص وتحليل تتبع الميتوكوندريا: (1) تحديد الميتوكوندريا من الخلفية في كل إطار ، و (2) تحليل وتوليد الروابط بين كل إطار. في حل التحدي الأول ، يتم استخدام نهج وضع العلامات على نطاق واسع لتمييز الميتوكوندريا عن الخلفية ، مثل صبغة MitoTracker أو الترانفسيفان للميتوكوندريا المنصهر ة الفلورية التي تستهدف البروتين (على سبيل المثال ، mito-GFP)6،7،8. لتحليل الارتباط بين الإطارات ، تم وصف العديد من الخوارزميات وأدوات البرامج في الدراسات السابقة9. في ورقة حديثة، قارن الباحثون أربع أدوات آلية مختلفة (على سبيل المثال، Volocity، Imaris، wrMTrck، وتعقب الفرق) لتحديد النقل الميتوكوندريا. وأظهرت النتائج أنه على الرغم من التناقضات في طول المسار، وإزاحة الميتوكوندريا، ومدة الحركة، والسرعة، فإن هذه الأدوات الآلية مناسبة لتقييم فرق النقل بعد العلاج10. بالإضافة إلى هذه الأدوات ، تم استخدام البرنامج المساعد المتكامل “وحدات الماكرو” لImageJ (كتبه ريتدورف وSeitz) على نطاق واسع لتحليل نقل الميتوكوندريا11. تولد هذه الطريقة الكيموغرافيات التي يمكن استخدامها لتحليل حركة الميتوكوندريا، بما في ذلك السرعة في كل من الاتجاهات السابقة وإلى الوراء.
الميتوكوندريا هي العضيات ديناميكية للغاية التي تتغير باستمرار في العدد والمورفولوجيا استجابة لكل من الحالات الفسيولوجية والمرضية. الانشطار الميتوكوندريا والانصهار تنظيم بإحكام مورفولوجيا الميتوكوندريا والتوازن. يمكن أن يؤدي عدم التوازن بين الانشطار الميتوكوندريا والانصهار إلى شبكات الميتوكوندريا القصيرة أو الطويلة للغاية ، والتي يمكن أن تضعف وظيفة الميتوكوندريا وتؤدي إلى أنشطة عصبية غير طبيعية وانحطاط عصبي. ويشارك ضعف نقل الميتوكوندريا ومورفولوجيا في مختلف الأمراض العصبية التنكسية, مثل مرض الزهايمر, مرض باركنسون, مرض هنتنغتون, والشلل النصفي التشنجي الوراثي (HSP)12,13,14,15. HSP هي مجموعة غير متجانسة من الاضطرابات العصبية الموروثة التي تتميز بانحطاط الجهاز القشري والفشل اللاحق في السيطرة على عضلات الأطراف السفلية16،17. في هذه الدراسة, وتستخدم الخلايا العصبية الأمامية المستمدة من iPSC لتقييم نقل الميتوكوندريا ومورفولوجيا في HSP. توفر هذه الطريقة نموذجًا فريدًا لفحص ديناميكيات الميتوكوندريا من المحاور العصبية في الثقافات الحية.
Protocol
Representative Results
Discussion
تصف هذه المقالة طريقة لتحليل نقل الميتوكوندريا ومورفولوجيا في محاور عصبية باستخدام صبغة الفلورسنت الحمراء وبرنامج ImageJ ، وكلاهما يوفر منصة فريدة لدراسة الضمور المحوري ومورفولوجيا الميتوكوندريا في الأمراض العصبية. هناك العديد من الخطوات الهامة في البروتوكول ، بما في ذلك تلطيخ الميتوكون?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة الشلل النصفي التشنجي، ومؤسسة بليزر، والمعهد الوطني للصحة (R21NS109837).
Materials
| Accutase Cell Detachment Solution | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| Biosafety hood | Thermo Scientific | 1300 SERIES A2 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A-7906 | |
| Brain derived neurotrophic factor (BDNF) | Peprotech | 450-02 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall Legend X1R/ 75004261 | |
| Coverslips | Chemiglass Life Sciences | 1760-012 | |
| Cyclic AMP (cAMP) | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | |
| Dorsomorphin | Selleckchem | S7146 | |
| Dulbecco's modified eagle medium with F12 nutrient mixture (DMEM/F12) | Corning | 10-092-CV | |
| FBS | Gibco | 16141-002 | |
| Fibroblast growth factor 2 (FGF2, bFGF) | Peprotech | 100-18B | |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Gibco | A1413201 | |
| Gem21 NeuroPlex Serum-Free Supplement | Gemini | 400-160 | |
| Glass Bottom Dishes | MatTek | P35G-0.170-14-C | |
| 9'' glass pipetes | VWR | 14673-043 | |
| Glial derived neurotrophic factor (BDNF) | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| GlutaMAX-I | Gibco | 35050-061 | |
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| Insulin growth factor 1 (IGF1) | Invitrogen | M7512 | |
| Knockout Serum Replacer | Gibco | A31815 | |
| Laminin | Sigma | L-6274 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148-100ML | |
| MitoTracker CMXRos | Invitrogen | M7512 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| Non Essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | |
| N2 NeuroPle Serum-Free Supplement | Gemini | 400-163 | |
| Olympus microscope IX83 | Olympus | IX83-ZDC2 | |
| PBS | Corning | 21-031-CV | |
| Phase contrast microscope | Olympus | CKX41/ IX2-SLP | |
| 6 well plates | Corning | 353046 | |
| 24 well plates | Corning | 353047 | |
| Poly-L-ornithine hydrobromide (polyornithine)) | Sigma-Aldrich | P3655 | |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010 | |
| Sterile 50ml Disposable Vacuum Filtration System 0.22 μm Millipore Express® Plus Membrane | Millipore | SCGP00525 | |
| Stericup 500/1000 ml Durapore 0.22 μM PVDF | Millipore | SCGVU10RE | |
| Tbr1 antibody (1:2000) | Chemicon | AB9616 | |
| Trypsin inhibitor | Gibco | 17075029 | |
| 50 ml tubes | Phenix | SS-PH50R | |
| 15 ml tubes | Phenix | SS-PH15R | |
| T25 flasks (untreated) | VWR | 10861-572 | |
| Plugins for softwares | |||
| Bio-formats Package | http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/5.1.0/ | ||
| Fiji software | https://fiji.sc/ | ||
| Kymograph Plugin | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| MultipleKymograph.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| MultipleOverlay.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| WalkingAverage.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| StackDifference.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| Straighten_.jar | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/straighten.html | ||
| tsp050706.txt | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html |
References
- Brown, A. Axonal transport of membranous and nonmembranous cargoes: a unified perspective. Journal of Cell Biology. 160 (6), 817-821 (2003).
- Morris, R. L., Hollenbeck, P. J. Axonal transport of mitochondria along microtubules and F-actin in living vertebrate neurons. The Journal of Cell Biology. 131 (5), 1315-1326 (1995).
- Schwarz, T. L. Mitochondrial trafficking in neurons. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (6), (2013).
- Magrane, J., Cortez, C., Gan, W. B., Manfredi, G. Abnormal mitochondrial transport and morphology are common pathological denominators in SOD1 and TDP43 ALS mouse models. Human Molecular Genetics. 23 (6), 1413-1424 (2014).
- Alami, N. H., et al. Axonal transport of TDP-43 mRNA granules is impaired by ALS-causing mutations. Neuron. 81 (3), 536-543 (2014).
- Wang, X., Schwarz, T. L. Imaging axonal transport of mitochondria. Methods in Enzymology. 457, 319-333 (2009).
- Course, M. M., et al. Live Imaging Mitochondrial Transport in Neurons. Neuromethods. 123, 49-66 (2017).
- Chazotte, B. Labeling mitochondria with fluorescent dyes for imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (6), 4948 (2009).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
- Bros, H., Hauser, A., Paul, F., Niesner, R., Infante-Duarte, C. Assessing Mitochondrial Movement Within Neurons: Manual Versus Automated Tracking Methods. Traffic. 16 (8), 906-917 (2015).
- Calkins, M. J., Manczak, M., Mao, P., Shirendeb, U., Reddy, P. H. Impaired mitochondrial biogenesis, defective axonal transport of mitochondria, abnormal mitochondrial dynamics and synaptic degeneration in a mouse model of Alzheimer’s disease. Human Molecular Genetics. 20 (23), 4515-4529 (2011).
- Denton, K., et al. Impaired mitochondrial dynamics underlie axonal defects in hereditary spastic paraplegias. Human Molecular Genetics. 27 (14), 2517-2530 (2018).
- Kim-Han, J. S., Antenor-Dorsey, J. A., O’Malley, K. L. The parkinsonian mimetic, MPP+, specifically impairs mitochondrial transport in dopamine axons. Journal of Neuroscience. 31 (19), 7212-7221 (2011).
- Shirendeb, U. P., et al. Mutant huntingtin’s interaction with mitochondrial protein Drp1 impairs mitochondrial biogenesis and causes defective axonal transport and synaptic degeneration in Huntington’s disease. Human Molecular Genetics. 21 (2), 406-420 (2012).
- Lo Giudice, T., Lombardi, F., Santorelli, F. M., Kawarai, T., Orlacchio, A. Hereditary spastic paraplegia: clinical-genetic characteristics and evolving molecular mechanisms. Experimental Neurology. 261, 518-539 (2014).
- Blackstone, C. Cellular pathways of hereditary spastic paraplegia. Annual Review of Neuroscience. 35, 25-47 (2012).
- Boisvert, E. M., Denton, K., Lei, L., Li, X. J. The specification of telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments. (74), e50321 (2013).
- Zhu, P. P., Denton, K. R., Pierson, T. M., Li, X. J., Blackstone, C. Pharmacologic rescue of axon growth defects in a human iPSC model of hereditary spastic paraplegia SPG3A. Human Molecular Genetics. 23 (21), 5638-5648 (2014).
- Marra, M. H., Tobias, Z. J., Cohen, H. R., Glover, G., Weissman, T. A. In Vivo Time-Lapse Imaging in the Zebrafish Lateral Line: A Flexible, Open-Ended Research Project for an Undergraduate Neurobiology Laboratory Course. Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 13 (3), 215-224 (2015).
- Kang, J. S., et al. Docking of axonal mitochondria by syntaphilin controls their mobility and affects short-term facilitation. Cell. 132 (1), 137-148 (2008).
- Mou, Y., Li, X. J. Rescue axonal defects by targeting mitochondrial dynamics in hereditary spastic paraplegias. Neural Regeneration Research. 14 (4), 574-577 (2019).
- Huang, S., et al. New photostable naphthalimide-based fluorescent probe for mitochondrial imaging and tracking. Biosensors & Bioelectronics. 71, 313-321 (2015).
- Carvalho, P. H., et al. Designed benzothiadiazole fluorophores for selective mitochondrial imaging and dynamics. Chemistry. 20 (47), 15360-15374 (2014).
- Yamakoshi, H., et al. A sensitive and specific Raman probe based on bisarylbutadiyne for live cell imaging of mitochondria. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 25 (3), 664-667 (2015).
- Neumann, S., Chassefeyre, R., Campbell, G. E., Encalada, S. E. KymoAnalyzer: a software tool for the quantitative analysis of intracellular transport in neurons. Traffic. 18 (1), 71-88 (2017).
- Chen, M., et al. A new method for quantifying mitochondrial axonal transport. Protein & Cell. 7 (11), 804-819 (2016).
- De Vos, K. J., Sheetz, M. P. Visualization and quantification of mitochondrial dynamics in living animal cells. Methods in Cell Biology. 80, 627-682 (2007).
- Denton, K. R., Xu, C. C., Li, X. J. Modeling Axonal Phenotypes with Human Pluripotent Stem Cells. Methods in Molecular Biology. 1353, 309-321 (2016).
- Andrews, S., Gilley, J., Coleman, M. P. Difference Tracker: ImageJ plugins for fully automated analysis of multiple axonal transport parameters. Journal of Neuroscience Methods. 193 (2), 281-287 (2010).
- Reis, G. F., et al. Molecular motor function in axonal transport in vivo probed by genetic and computational analysis in Drosophila. Molecular Biology of the Cell. 23 (9), 1700-1714 (2012).
- Broeke, J. H., et al. Automated quantification of cellular traffic in living cells. Journal of Neuroscience Methods. 178 (2), 378-384 (2009).
- Welzel, O., Knorr, J., Stroebel, A. M., Kornhuber, J., Groemer, T. W. A fast and robust method for automated analysis of axonal transport. European Biophysics Journal : EBJ. 40 (9), 1061-1069 (2011).
- Mukherjee, A., et al. Automated kymograph analysis for profiling axonal transport of secretory granules. Medical Image Analysis. 15 (3), 354-367 (2011).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays monitoring autophagy. Autophagy. 12, 1 (2016).
- Metivier, D., et al. Cytofluorometric detection of mitochondrial alterations in early CD95/Fas/APO-1-triggered apoptosis of Jurkat T lymphoma cells. Comparison of seven mitochondrion-specific fluorochromes. Immunology Letters. 61 (2-3), 157-163 (1998).
- Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives. Biophysical Journal. 76, 469-477 (1999).
- Liu, X., Yang, L., Long, Q., Weaver, D., Hajnoczky, G. Choosing proper fluorescent dyes, proteins, and imaging techniques to study mitochondrial dynamics in mammalian cells. Biophysics Reports. 3 (4), 64-72 (2017).
- Zhou, B., Lin, M. Y., Sun, T., Knight, A. L., Sheng, Z. H. Characterization of mitochondrial transport in neurons. Methods in Enzymology. 547, 75-96 (2014).
