Estimulación in Vitro y visualización de la liberación de trampas extracelulares en macrófagos derivados de monocitos humanos diferenciados

La liberación de ETs de neutrófilos se identificó por primera vez como una respuesta inmune innata desencadenada por una infección bacteriana¹. Consisten en una columna vertebral del ADN a la que se unen varias proteínas de gránulos con propiedades antibacterianas, incluyendo la aslastasa de neutrófilos y mieloperoxidasa². El papel principal de las ET de neutrófilos (NET) es capturar patógenos y facilitar su eliminación³. Sin embargo, además del papel protector de las ET en la defensa inmunitaria, un número cada vez mayor de estudios también han descubierto un papel en la patogénesis de la enfermedad, particularmente durante el desarrollo de enfermedades impulsadas por la inflamación (es decir, artritis reumatoide y aterosclerosis⁴). La liberación de ETs puede ser desencadenada por varias citoquinas proinflamatorias incluyendo interleucina 8 (IL-8) y factor de necrosis tumoral alfa (TNF)^5,6, y la acumulación localizada de ETs puede aumentar el daño tisular y evocar una respuesta proinflamatoria⁷. Por ejemplo, las ET se han implicado como un papel causal en el desarrollo de la aterosclerosis^8,promoviendo la trombosis⁹, y prediciendo el riesgo cardiovascular¹⁰.

Ahora se reconoce que, además de los neutrófilos, otras células inmunitarias (es decir, células de mástil, eosinófilos y macrófagos) también pueden liberar ET en la exposición a la estimulación microbiana o proinflamatoria^11,12. Esto puede ser particularmente significativo en el caso de los macrófagos, teniendo en cuenta su papel clave en el desarrollo, la regulación y la resolución de enfermedades inflamatorias crónicas. Por lo tanto, es importante obtener una mayor comprensión de la relación potencial entre la liberación ET de los macrófagos y el desarrollo de enfermedades relacionadas con la inflamación. Estudios recientes han demostrado la presencia de MET y NETs en placas ateroscleróticas humanas intactas y trombos organizados¹³. Del mismo modo, los MET se han implicado en la conducción de lesiones renales a través de la regulación de las respuestas inflamatorias¹⁴. Sin embargo, a diferencia de los neutrófilos, hay datos limitados sobre los mecanismos de formación de MET a partir de macrófagos. Estudios recientes que utilizan modelos in vitro humanos de formación MET muestran algunas diferencias en las vías involucradas en cada tipo de célula (es decir, con respecto a la ausencia de citrulinación histona con macrófagos)⁶. Sin embargo, algunos han demostrado que la versión NET también puede ocurrir en ausencia de histona citrullination¹⁵.

El objetivo general de este protocolo es proporcionar un método simple y directo para evaluar la liberación de MET en un modelo de macrófagos clínicamente relevante. Hay una serie de diferentes modelos de células de macrófagos in vitro que se han utilizado para estudiar los MET (es decir, la línea celular de monocitos humanos THP-1 y varias líneas celulares de macrófagos murinos)¹⁶. Hay algunas limitaciones asociadas con estos modelos. Por ejemplo, la diferenciación de los monocitos THP-1 a los macrófagos generalmente requiere un paso de cebado, como la adición de acetato de mirista phorbol (PMA), que a su vez activa las vías dependientes de la proteína quinasa C (PKC). Este proceso es conocido por desencadenar la liberación de ET⁴ y da como resultado una liberación basal baja de MET de las células THP-1. Otros estudios han puesto de relieve algunas diferencias en la bioactividad y las respuestas inflamatorias montadas por los macrófagos in vivo en comparación con las células THP-1 tratadas con PMA^17.

Del mismo modo, el comportamiento y las respuestas inflamatorias de diferentes líneas celulares similares a macrófagos murinos no representan completamente el espectro de respuesta de los macrófagos humanos primarios^18. Por lo tanto, con el fin de investigar la formación de ET de macrófagos en el entorno clínico, se cree que los macrófagos derivados de monocitos humanos primarios (HMM) son un modelo más relevante en lugar de líneas celulares monocíticas o similares a la murina.

La liberación de ET de los HMMAM polarizados M1 se ha demostrado después de la exposición de estas células a una serie de diferentes estímulos inflamatorios, incluyendo el ácido hipocloroso oxidante derivado de mieloperoxidasa (HOCl), PMA, TNF, e IL-8⁶. Aquí se describe un protocolo para polarizar los HMMAM al fenotipo M1 y visualizar la posterior liberación de MET tras la exposición a estos estímulos inflamatorios. PMA se utiliza como un estímulo de la liberación de MET para facilitar las comparaciones con estudios anteriores que han utilizado neutrófilos. Es importante destacar que HOCl, IL-8 y TNF también se utilizan para estimular la liberación de MET, que se cree que son mejores modelos del ambiente inflamatorio in vivo. El método microscópico para la visualización de la liberación de ET consiste en tinchar el ADN extracelular en cultivos de células vivas utilizando SYTOX green, una mancha de ácido nucleico verde fluorescente impermeable que se ha aplicado con éxito en estudios anteriores de neutrófilos. Este método permite una evaluación rápida y cualitativa de la versión ET, pero no es apropiado como método independiente para la cuantificación de la extensión de liberación ET. Se debe utilizar una metodología alternativa si se requiere cuantificación para comparar el alcance de la liberación de ET resultante de diferentes condiciones o intervenciones de tratamiento.