В экстракорпоральная стимуляция и визуализация внеклеточной ловушки релиз в дифференцированных человеческих моноцитов полученных макрофагов

Высвобождение ETs от нейтрофилов было впервые определено как врожденный иммунный ответ, вызванный бактериальной инфекцией¹. Они состоят из позвоночника ДНК, к которому связаны различные гранулированные белки с антибактериальными свойствами, втомся нейтрофил эластаза и миелопероксидаза^2. Основная роль нейтрофилов ETs (NETs) заключается в захвате патогенных микроорганизмов и содействовать их ликвидации³. Однако, в дополнение к защитной роли ЭТ в иммунной защите, все большее число исследований также обнаружили роль в патогенезе болезни, особенно во время развития воспаления управляемых заболеваний (т.е. ревматоидного артрита и атеросклероз⁴). Высвобождение ETs может быть вызвано различными провоспалительными цитокинами, включая интерлейкин 8 (IL-8) и фактор некроза опухоли альфа (ТНФЗ)^5,6, и локализованное накопление ETs может увеличить повреждение тканей и вызвать провоспалительный ответ⁷. Например, ETs были замешаны как играющие причинно-следственную роль в развитии атеросклероза⁸, содействие тромбозу⁹, и прогнозирование сердечно-сосудистого риска¹⁰.

В настоящее время признано, что в дополнение к нейтрофилов, другие иммунные клетки (т.е., тучные клетки, эозинофилы, и макрофаги) может также освободить ETs на воздействие микробной или про-воспалительной стимуляции^11,12. Это может быть особенно важно в случае макрофагов, учитывая их ключевую роль в развитии, регуляции и разрешении хронических воспалительных заболеваний. Поэтому важно получить более глубокое понимание потенциальной взаимосвязи между выходом ET из макрофагов и развитием болезней, связанных с воспалением. Недавние исследования показали наличие МЕТ и NET в нетронутых человека атеросклеротических бляшек и организованных^{тромбов 13}. Аналогичным образом, METs были вовлечены в вождения травмы почек через регулирование воспалительных реакций¹⁴. Однако, в отличие от нейтрофилов, имеются ограниченные данные о механизмах формирования МЕТ из макрофагов. Недавние исследования с использованием человеческих моделей in vitro образования MET показывают некоторые различия в путях, участвующих в каждом типе клеток (т.е. в отношении отсутствия цитруллинации гистона с макрофагами)⁶. Тем не менее, некоторые из них показали, что NET релиз также может произойти в отсутствие гистон цитруллинации¹⁵.

Общая цель этого протокола заключается в предоставлении простого и прямого метода оценки выпуска MET в клинически релевантной модели макрофагов. Есть целый ряд различных моделей макрофагов in vitro, которые были использованы для изучения METs (т.е. линии моноцитов человека THP-1 и различных линий макрофагов murine)¹⁶. Есть некоторые ограничения, связанные с этими моделями. Например, дифференциация моноцитов THP-1 на макрофагы обычно требует грунтового шага, такого как добавление phorbol myristate acetate (PMA), который сам активирует белковую киназу C (PKC)-зависимые пути. Этот процесс, как известно, вызывает ET релиз⁴ и приводит к низкой базальной MET релиз из клеток THP-1. Другие исследования выявили некоторые различия в биоактивности и воспалительных реакций, установленных макрофагов in vivo по сравнению с PMA-обработанных клеток THP-1¹⁷.

Аналогичным образом, поведение и воспалительные реакции различных макрофагов, похожих на минына, клеточные линии не полностью представляют спектр реакции первичных макрофагов человека¹⁸. Таким образом, с целью изучения образования макрофагов ET в клинических условиях, первичные человеческие моноциты полученных макрофагов (HMDMs), как полагают, более релевантной модели, а не моноцитные или мурин макрофаг-подобных клеточных линий.

ET релиз от M1 поляризованных HMDMs было продемонстрировано после воздействия этих клеток на ряд различных воспалительных стимулов, в том числе миелопероксидаза полученных окислительной гипохлорной кислоты (HOCl), PMA, TNF и IL-8⁶. Описано здесь протокол для поляризации HMDMs на M1 фенотип и визуализировать последующее освобождение MET при воздействии этих воспалительных стимулов. PMA используется в качестве стимула MET релиз для облегчения сравнения с предыдущими исследованиями, которые использовали нейтрофилов. Важно отметить, что HOCl, IL-8 и TNF также используются для стимулирования выпуска MET, которые, как полагают, являются лучшими моделями воспалительной среды in vivo. Микроскопический метод визуализации ET релиз включает в себя окрашивание внеклеточной ДНК в живых клеточных культурах с помощью SYTOX зеленый, непроницаемый флуоресцентный зеленый нуклеиновой кислоты пятно, которое было успешно применено в предыдущих исследованиях нейтрофилов. Этот метод позволяет быстро и качественно оценить выпуск ET, но он не подходит в качестве отдельного метода для количественной оценки объема выпуска ET. Альтернативная методология должна использоваться, если требуется количественная оценка для сравнения масштабов выпуска ET в результате различных условий лечения или вмешательства.