Estimulação e visualização in vitro da liberação extracelular da armadilha em macrófagos humanos monocyte-derivados diferenciados

A liberação de ETs de neutrófilos foi identificada pela primeira vez como uma resposta imune inata desencadeada pela infecção bacteriana^1. Eles consistem em uma espinha dorsal de DNA para que várias proteínas de grânulo com propriedades antibacterianas estão ligadas, incluindo elastase neutrófilo e mieloperoxidase². O principal papel dos ETs neutrófilos (NETs) é capturar patógenos e facilitar a sua eliminação³. No entanto, além do papel protetor dos ETs na defesa imunológica, um número crescente de estudos também descobriu um papel na patogênese da doença, particularmente durante o desenvolvimento de doenças transmitidas por inflamação (ou seja, artrite reumatóide e aterosclerose^4). A liberação de ETs pode ser desencadeada por várias citocinas pró-inflamatórias, incluindo interleucina 8 (IL-8) e fator de necrose tumoral alfa (TNFα)^5,6, e o acúmulo localizado de ETs pode aumentar os danos nos tecidos e evocar um resposta pró-inflamatória⁷. Por exemplo, os ETs têm sido implicados como desempenhando um papel causal no desenvolvimento da aterosclerose^8,promovendo a trombose^9,e prevendo o risco cardiovascular¹⁰.

Agora é reconhecido que, além de neutrófilos, outras células imunes (ou seja, células de mastro, eosinófilos e macrófagos) também podem liberar ETs na exposição à estimulação microbiana ou pró-inflamatória^11,12. Isso pode ser particularmente significativo no caso dos macrófagos, considerando seu papel fundamental no desenvolvimento, regulação e resolução de doenças inflamatórias crônicas. Portanto, é importante obter uma maior compreensão da relação potencial entre a liberação de ET de macrófagos e desenvolvimento de doenças relacionadas à inflamação. Estudos recentes têm mostrado a presença de METs e NETs em placas ateroscleróticas humanas intactas e^trombo13organizado. Da mesma forma, mets têm sido implicados na condução de lesões renais através da regulação de respostas inflamatórias¹⁴. No entanto, em contraste com os neutrófilos, existem dados limitados sobre os mecanismos de formação met de macrófagos. Estudos recentes usando modelos in vitro humanos de formação MET mostram algumas diferenças nas vias envolvidas em cada tipo de célula (ou seja, em relação à ausência de citrulização histona com macrófagos)⁶. No entanto, alguns mostraram que a liberação net também pode ocorrer na ausência de histona ciitrullination¹⁵.

O objetivo geral deste protocolo é fornecer um método simples e direto para avaliar a liberação do MET em um modelo de macrófago clinicamente relevante. Existem uma série de diferentes modelos de células de macrófagos in vitro que têm sido usados para estudar METs (ou seja, a linha de células monócito humana THP-1 e várias linhas de células de^macrófagosmurine) 16 . Existem algumas limitações associadas a esses modelos. Por exemplo, a diferenciação de monócitos THP-1 para macrófagos geralmente requer um passo de preparação, como a adição de acetato phorbol myristate (PMA), que por si só ativa proteína kinase C (PKC) vias dependentes. Este processo é conhecido por desencadear a liberação de ET⁴ e resulta em uma liberação baixo basal MET de células THP-1. Outros estudos destacaram algumas diferenças na bioatividade e respostas inflamatórias montadas por macrófagos in vivo em comparação com as células THP-1 tratadas com PMA¹⁷.

Da mesma forma, o comportamento e as respostas inflamatórias de diferentes linhas celulares semelhantes a macrófagos de urina não representam completamente o espectro de resposta dos macrófagos humanos primários¹⁸. Portanto, com a finalidade de investigar a formação de ET de macrófagos no ambiente clínico, acredita-se que os macrófagos humanos primários derivados de monócito (HMDMs) sejam um modelo mais relevante do que linhas celulares monocíticas ou murina semelhantes a macrófagos.

A liberação de ET de HMDMs polarizados M1 foi demonstrada após a exposição dessas células a uma série de diferentes estímulos inflamatórios, incluindo o ácido ocorrecloloso oxidante derivado da mieloperoxidase (HOCl), PMA, TNFα e IL-8⁶. Descrito aqui é um protocolo para polarizar HMDMs ao fenótipo M1 e visualizar a liberação met subseqüente após a exposição a esses estímulos inflamatórios. Pma é usado como um estímulo de liberação MET para facilitar comparações com estudos anteriores que usaram neutrófilos. Importante, HOCl, IL-8, e TNFα são usados igualmente para estimular a liberação MET, que são acreditadas para ser melhores modelos do ambiente inflamatório in vivo. O método microscópico para visualização da liberação de ET envolve a coloração do DNA extracelular em culturas de células vivas usando o verde SYTOX, uma mancha de ácido nucleico verde fluorescente impermeável que tem sido aplicada com sucesso em estudos anteriores de neutrófilos. Este método permite uma avaliação rápida e qualitativa da liberação de ET, mas não é apropriado como um método autônomo para a quantificação da extensão de liberação de ET. Metodologia alternativa deve ser usada se a quantificação for necessária para comparar a extensão da liberação de ET resultante de diferentes condições ou intervenções de tratamento.