Stimolazione in vitro e visualizzazione del rilascio di trap extracellulari nei Macrofagi derivati da Monciti Umani differenziati
Summary
Presentato qui è un protocollo per rilevare la produzione di trap extracellulari macrofalo (MET) nella coltura di cellule vive utilizzando microscopia e colorazione a fluorescenza. Questo protocollo può essere ulteriormente esteso per esaminare specifici marcatori proteici MET mediante colorazione immunofluorescenza.
Abstract
Il rilascio di trappole extracellulari (ET) da parte dei neutrofili è stato identificato come un fattore che contribuisce allo sviluppo di malattie legate all’infiammazione cronica. Neutrophil ETs (NETs) sono costituiti da una rete di DNA, proteine istone, e varie proteine granulo (cioè, mieloperossiasi, elastasi, e cathepsin G). Altre cellule immunitarie, compresi i macrofagi, possono anche produrre ET; tuttavia, fino a che punto ciò si verifica in vivo e se le trappole extracellulari dei macrofazini (MET) svolgono un ruolo nei meccanismi patologici non è stato esaminato in dettaglio. Per comprendere meglio il ruolo delle MET nelle patologie infiammatorie, è stato sviluppato un protocollo per visualizzare il rilascio di MET dai macrofagi umani primari in vitro, che può essere sfruttato anche negli esperimenti di immunofluorescenza. Ciò consente un’ulteriore caratterizzazione di queste strutture e il loro confronto con gli ET rilasciati dai neutrofili. I macrofagi derivati dai monofati umani (HMDM) producono MET dopo l’esposizione a diversi stimoli infiammatori a seguito della differenziazione al fenotipo pro-infiammatorio M1. Il rilascio di MET può essere visualizzato mediante microscopia utilizzando una macchia di acido nucleico fluorescente verde che è impermeantto alle cellule vive (ad esempio, verde SYTOX). L’uso di macrofagi primari appena isolati, come l’HMDM, è vantaggioso nella modellazione di eventi infiammatori in vivo rilevanti per potenziali applicazioni cliniche. Questo protocollo può essere utilizzato anche per studiare il rilascio di MET da linee cellulari monocitiche umane (ad esempio, THP-1) a seguito di differenziazione in macrofagi con acetato di mirino phorbol o altre linee cellulari di macrofalo (ad esempio, le cellule J774A.1 simili a murini.
Introduction
Il rilascio di ET dai neutrofili è stato identificato per la prima volta come una risposta immunitaria innata innescata da infezione batterica1. Sono costituite da una spina dorsale del DNA a cui sono legate varie proteine del granulo con proprietà antibatteriche, tra cui l’elastasi neutrofilo e la mieloperossia2. Il ruolo principale degli ET neutrofili (NET) è quello di catturare gli agenti patogeni e facilitarne l’eliminazione3. Tuttavia, oltre al ruolo protettivo degli ET nella difesa immunitaria, un numero crescente di studi ha anche scoperto un ruolo nella patogenesi della malattia, in particolare durante lo sviluppo di malattie basate sull’infiammazione (ad es. artrite reumatoide e aterosclerosi4). Il rilascio degli ET può essere innescato da varie citochine pro-infiammatorie, tra cui l’interleuchina 8 (IL-8) e il fattore di necrosi tumorale alfa (TNF)5,6, e l’accumulo localizzato di ET può aumentare i danni ai tessuti ed evocare risposta pro-infiammatoria7. Ad esempio, le ET sono state implicate come un ruolo causale nello sviluppo dell’aterosclerosi8,promuovendo la trombosi9e prevedendo il rischio cardiovascolare10.
Ora si riconosce che oltre ai neutrofili, altre cellule immunitarie (ad esempio, mastociti, eosofili e macrofagi) possono anche rilasciare ET in caso di esposizione alla stimolazione microbica o pro-infiammatoria11,12. Questo può essere particolarmente significativo nel caso dei macrofagi, considerando il loro ruolo chiave nello sviluppo, nella regolamentazione e nella risoluzione delle malattie infiammatorie croniche. Pertanto, è importante ottenere una maggiore comprensione della potenziale relazione tra il rilascio di ET dai macrofagi e lo sviluppo di malattie correlate all’infiammazione. Recenti studi hanno dimostrato la presenza di MET e NET in placche aterosclerotiche umane intatte e trombi organizzi13. Allo stesso modo, i MET sono stati implicati nel guidare lesioni renali attraverso la regolazione delle risposte infiammatorie14. Tuttavia, a differenza dei neutrofili, ci sono dati limitati sui meccanismi della formazione MET dai macrofagi. Recenti studi che utilizzano modelli in vitro umano di formazione MET mostrano alcune differenze nei percorsi coinvolti in ogni tipo di cellula (cioè, per quanto riguarda l’assenza di citrigazione istone con macrofagi)6. Tuttavia, alcuni hanno dimostrato che il rilascio di NET può verificarsi anche in assenza di citrullination istone15.
L’obiettivo generale di questo protocollo è quello di fornire un metodo semplice e diretto per valutare il rilascio MET in un modello di macrofago clinicamente rilevante. Ci sono un certo numero di diversi modelli di cellule di macrofago in vitro che sono stati utilizzati per studiare MET (cioè, la linea cellulare monocito umano THP-1 e varie linee cellulari del macrofano murino)16. Esistono alcune limitazioni associate a questi modelli. Ad esempio, la differenziazione dei monociti THP-1 ai macrofagi richiede solitamente una fase di innesco, come l’aggiunta di acetato di forbol miristatico (PMA), che a sua volta attiva percorsi dipendenti dalla chinasi proteica C (PKC). Questo processo è noto per innescare larelease 4 ET e si traduce in un basso rilascio MET basale da cellule THP-1. Altri studi hanno evidenziato alcune differenze nella bioattività e nelle risposte infiammatorie montate dai macrofagi in vivo rispetto alle cellule THP-1 trattate daPMA.
Allo stesso modo, il comportamento e le risposte infiammatorie di diverse linee cellulari simili a macrofagi murini non rappresentano completamente lo spettro di risposta dei macrofagi umani primari18. Pertanto, allo scopo di studiare la formazione di ET macrofaci nell’ambiente clinico, si ritiene che i macrofagi derivati da monofagi (HMDM) primari siano un modello più rilevante piuttosto che linee cellulari monocitiche o murine simili a macrofagi.
Il rilascio di ET dagli HMDM polarizzati M1 è stato dimostrato in seguito all’esposizione di queste cellule a diversi stimoli infiammatori, tra cui l’acido ipocilno ossidante derivato da mieloperossia derivato da minidrica (HOCl), PMA, TNF e IL-86. Descritto qui è un protocollo per polarizzare gli HMDM al fenotipo M1 e visualizzare il successivo rilascio MET dopo l’esposizione a questi stimoli infiammatori. PMA è usato come stimolo del rilascio MET per facilitare il confronto con studi precedenti che hanno usato neutrofili. È importante sottolineare che, HOCl, IL-8, e TNF , sono utilizzati anche per stimolare il rilascio di MET, che si crede di essere modelli migliori dell’ambiente infiammatorio in vivo. Il metodo microscopico per la visualizzazione del rilascio di ET consiste nel macchiare il DNA extracellulare nelle colture di cellule vive utilizzando il verde SYTOX, una macchia di acido nucleico verde fluorescente impermeabile che è stata applicata con successo nei precedenti studi neutrofili. Questo metodo consente una valutazione rapida e qualitativa del rilascio di ET, ma non è appropriato come metodo autonomo per la quantificazione dell’estensione del rilascio ET. La metodologia alternativa deve essere utilizzata se è necessaria la quantificazione per confrontare l’entità del rilascio di ET derivante da diverse condizioni o interventi di trattamento.
Protocol
Representative Results
Discussion
La generazione e la visualizzazione della formazione MET utilizzando HmDM differenziate M1 rappresenta un nuovo modello in vitro che può essere utile per studiare il potenziale ruolo patologico di queste strutture macrofaghe, in particolare sotto l’infiammatorio cronico Condizioni. Fornisce un protocollo robusto per la stimolazione dei macrofagi umani primari per rilasciare MET, che può anche essere utilizzato in studi correlati con linee cellulari monociti o macrofagi murini. La riuscita implementazione di questo prot…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da un perpetual IMPACT Grant (IPAP201601422) e da Novo Nordisk Foundation Biomedical Project Grant (NNF17OC0028990). L’Australian Postgraduate Award da parte dell’Università di Sydney riconosce anche la ricezione di un Australian Postgraduate Award. Ringraziamo Pat Pisansarakit e la signora Morgan Jones per l’assistenza nell’isolamento dei monociti e nella cultura dei tessuti.
Materials
| 120Q broad spectrum fluorescent light source | EXFO Photonic Solutions, Toronto, Canada | x-cite series | |
| Corning CellBIND Multiple Well Plate (12 wells) | Sigma-Aldrich | CLS3336 | For cell culture |
| Differential Quik Stain Kit (Modified Giemsa) | Polysciences Inc. | 24606 | Characterisation of monocytes |
| Hanks balanced salt solution (HBSS) | Thermo-Fisher | 14025050 | For washing steps and HOCl treatment |
| Hypochlorous acid (HOCl) | Sigma-Aldrich | 320331 | For MET stimulation |
| Interferon gamma | Thermo-Fisher | PMC4031 | For M1 priming |
| Interleukin 4 | Integrated Sciences | rhil-4 | For M2 priming |
| Interleukin 8 | Miltenyl Biotec | 130-093-943 | For MET stimulation |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | 59202C | Added to culture media |
| Lipopolysaccharide | Integrated Sciences | tlrl-eblps | For M1 priming |
| Lymphoprep | Axis-Shield PoC AS | 1114544 | For isolation of monocytes |
| Olympus IX71 inverted microscope | Olympus, Tokyo, Japan | ||
| Phorbol 12- myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P8139 | For MET stimulation |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D5652 | For washing steps |
| RPMI-1640 media | Sigma-Aldrich | R8758 | For cell culture |
| SYTOX green | Life Technologies | S7020 | For MET visulaization |
| TH4-200 brightfield light source | Olympus, Tokyo, Japan | x-cite series | |
| Tumor necrosis factor alpha | Lonza | 300-01A-50 | For MET stimulation |
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