Stimulation in vitro et visualisation de la libération de piège extracellulaire dans les macrophages humains différenciés dérivés de monocytes

La libération d’ETs des neutrophiles a d’abord été identifiée comme une réponse immunitaire innée déclenchée par une infection bactérienne¹. Ils se composent d’une colonne vertébrale de l’ADN à laquelle diverses protéines de granule avec des propriétés antibactériennes sont liés, y compris l’élastase neutrophile et myeloperoxidase². Le rôle principal des ET neutrophiles (ENe) est de capturer les agents pathogènes et de faciliter leur élimination³. Cependant, en plus du rôle protecteur des ET dans la défense immunitaire, un nombre croissant d’études ont également découvert un rôle dans la pathogénie de la maladie, en particulier pendant le développement de maladies induites par l’inflammation (c.-à-d. la polyarthrite rhumatoïde et l’athérosclérose⁴). La libération des ET peut être déclenchée par diverses cytokines pro-inflammatoires, y compris l’interleukine 8 (IL-8) et le facteur de nécrose tumorale alpha (TNF)^5,6, et l’accumulation localisée d’ET peut augmenter les lésions tissulaires et évoquer un réponse pro-inflammatoire⁷. Par exemple, les ET ont été impliqués comme jouant un rôle causal dans le développement de l’athérosclérose⁸, la promotion de la thrombose⁹, et la prévision du risque cardiovasculaire¹⁰.

Il est maintenant reconnu qu’en plus des neutrophiles, d’autres cellules immunitaires (c.-à-d. les mastocytes, les éosinophiles et les macrophages) peuvent également libérer des ET lors de l’exposition à la stimulation microbienne ou pro-inflammatoire^11,12. Ceci peut être particulièrement significatif dans le cas des macrophages, considérant leur rôle clé dans le développement, la régulation, et la résolution des maladies inflammatoires chroniques. Par conséquent, il est important d’acquérir une meilleure compréhension de la relation potentielle entre la libération d’ET des macrophages et le développement de la maladie inflammation-connexe. Des études récentes ont montré la présence de METs et NETs dans les plaques atherosclérotiques humaines intactes et organisé thrombi¹³. De même, les MET ont été impliqués dans la conduite des lésions rénales par la régulation des réponses inflammatoires¹⁴. Cependant, contrairement aux neutrophiles, il existe peu de données sur les mécanismes de formation du MET à partir de macrophages. Des études récentes utilisant des modèles in vitro humains de formation MET montrent certaines différences dans les voies impliquées dans chaque type de cellule (c.-à-d., en ce qui concerne l’absence de citrullination histone avec des macrophages)⁶. Cependant, certains ont montré que la libération NET peut également se produire en l’absence de citrullination histone¹⁵.

L’objectif global de ce protocole est de fournir une méthode simple et directe pour évaluer la libération de MET dans un modèle de macrophage cliniquement pertinent. Il existe un certain nombre de différents modèles de cellules macrophages in vitro qui ont été utilisés pour étudier les ETM (c.-à-d., la lignée cellulaire monocyte humaine THP-1 et diverses lignées de cellules macrophages murine)¹⁶. Ces modèles sont liés à certaines limites. Par exemple, la différenciation des monocytes THP-1 aux macrophages nécessite généralement une étape d’amorçage, comme l’ajout d’acétate de myristate phorbol (PMA), qui active lui-même les voies dépendantes de la protéine kinase C (PKC). Ce processus est connu pour déclencher la libération ET⁴ et les résultats dans une libération basale faible MET des cellules THP-1. D’autres études ont mis en évidence certaines différences dans la bioactivité et les réponses inflammatoires montées par macrophages in vivo par rapport aux cellules THP-1 traitées par PMA¹⁷.

De même, le comportement et les réponses inflammatoires de différentes lignées cellulaires de type macrophage murine ne représentent pas complètement le spectre de réponse des macrophages humains primaires¹⁸. Par conséquent, dans le but d’étudier la formation d’ET de macrophage dans le cadre clinique, les macrophages humains primaires de monocyte-dérivé (HMDMs) sont censés être un modèle plus pertinent plutôt que monocytic ou murine macrophage-comme des lignes de cellules.

Et libération de M1 polarisé HMDMs a été démontré e après l’exposition de ces cellules à un certain nombre de stimuli inflammatoires différents, y compris l’acide hypochloreux oxydant dérivé de myeloperoxidase (HOCl), PMA, TNFMD, et IL-8⁶. Décrit ici est un protocole pour polariser des HMDM au phénotype de M1 et visualiser la libération suivante de MET sur l’exposition à ces stimulus inflammatoires. La PMA est utilisée comme stimulus de la libération de MET pour faciliter les comparaisons avec les études précédentes qui ont utilisé des neutrophiles. Fait important, HOCl, IL-8, et TNF sont également utilisés pour stimuler la libération met, qui sont censés être de meilleurs modèles de l’environnement inflammatoire in vivo. La méthode microscopique pour la visualisation de la libération et consiste à tacher l’ADN extracellulaire dans les cultures cellulaires vivantes à l’aide de SYTOX vert, une tache d’acide nucléique vert fluorescent imperméable qui a été appliquée avec succès dans les études précédentes neutrophile. Cette méthode permet une évaluation rapide et qualitative de la libération et de l’ET, mais elle n’est pas appropriée comme méthode autonome pour la quantification de l’étendue de la libération ET. Une autre méthode devrait être utilisée si la quantification est nécessaire pour comparer l’étendue de la libération d’ET résultant de différentes conditions de traitement ou interventions.