In vitro stimulatie en visualisatie van extracellulaire val afgifte in gedifferentieerde humane monocyte-afgeleide macrofagen

De afgifte van ETs uit neutrofielen werd voor het eerst geïdentificeerd als een aangeboren immuunrespons veroorzaakt door bacteriële infectie¹. Ze bestaan uit een DNA-ruggengraat waaraan verschillende korrel eiwitten met antibacteriële eigenschappen gebonden zijn, waaronder neutrofiele elastase en myeloperoxidase². De primaire rol van neutrofiele ETs (netten) is het opvangen van pathogenen en het vergemakkelijken van hun eliminatie³. Echter, naast de beschermende rol van ETs in immuun verdediging, een toenemend aantal studies hebben ook een rol in de ziekte-pathogenese ontdekt, vooral tijdens de ontwikkeling van ontsteking-gedreven ziekten (dat wil zeggen, reumatoïde artritis en atherosclerose⁴). De afgifte van ETS kan worden geactiveerd door verschillende pro-inflammatoire cytokines, met inbegrip van Interleukine 8 (Il-8) en tumor necrose factor alpha (tnfα)^5,6, en de gelokaliseerde accumulatie van ETS kan weefselschade te verhogen en roepen een pro-inflammatoire respons⁷. Bijvoorbeeld, ETs zijn betrokken als het spelen van een causale rol in de ontwikkeling van atherosclerose⁸, bevordering van trombose⁹, en het voorspellen van cardiovasculaire risico¹⁰.

Het wordt nu erkend dat naast neutrofielen ook andere immuuncellen (d.w.z. mestcellen, eosinofielen en macrofagen) ETS kunnen vrijgeven voor blootstelling aan de microbiële of pro-inflammatoire stimulatie^11,12. Dit kan bijzonder belangrijk zijn in het geval van macrofagen, gezien hun cruciale rol in de ontwikkeling, regulering en oplossing van chronische ontstekingsziekten. Daarom is het belangrijk om een beter begrip te krijgen van de potentiële relatie tussen ET-vrijlating van macrofagen en ontsteking-gerelateerde ziekte ontwikkeling. Recente studies hebben aangetoond dat de aanwezigheid van Mets en netten in intact menselijke atherosclerotische plaques en georganiseerde trombi¹³. Evenzo zijn METs betrokken bij het besturen van nierschade door de regulering van ontstekingsreacties¹⁴. Echter, in tegenstelling tot neutrofielen, er zijn beperkte gegevens over de mechanismen van MET vorming van macrofagen. Recente studies met behulp van humane in vitro modellen van MET formatie vertonen enkele verschillen in de trajecten die betrokken zijn bij elk celtype (d.w.z. met betrekking tot de afwezigheid van Histon-Citrullinatie met macrofagen)⁶. Echter, sommige hebben aangetoond dat netto vrijlating kan ook optreden in de afwezigheid van Histon-Citrullinatie¹⁵.

Het algemene doel van dit protocol is om een eenvoudige en directe methode te bieden om MET vrijgave te beoordelen in een klinisch relevant macrofaag model. Er zijn een aantal verschillende in vitro macrofaag celmodellen die zijn gebruikt om Mets te bestuderen (d.w.z. de thp-1 humane monocyt cellijn en verschillende muriene macrofaag cellijnen)¹⁶. Er zijn enkele beperkingen in verband met deze modellen. Bijvoorbeeld, de differentiatie van thp-1 monocyten aan macrofagen meestal vereist een priming stap, zoals de toevoeging van forbol myristaat acetaat (PMA), die zelf activeert proteïne kinase C (PKC)-afhankelijke trajecten. Dit proces is bekend om te activeren ET release⁴ en resulteert in een lage basale met release van thp-1 cellen. Andere studies hebben gewezen op enkele verschillen in bioactiviteit en ontstekingsreacties die in vivo door macrofagen zijn aangebracht in vergelijking met PMA-behandelde THP-1-cellen¹⁷.

Evenzo, het gedrag en inflammatoire reacties van verschillende muriene macrophage-achtige cellijnen niet volledig vertegenwoordigen de respons spectrum van primaire menselijke macrofagen¹⁸. Daarom worden met het oog op het onderzoeken van macrofaag et-vorming in de klinische setting, primaire humane monocyte-afgeleide macrofagen (hmdm’s) verondersteld een relevanter model te zijn in plaats van monocytische of muriene macrofaag-achtige cellijnen.

ET vrijlating van M1 gepolariseerde HMDMs is aangetoond na blootstelling van deze cellen aan een aantal verschillende ontstekings stimuli, waaronder het myeloperoxidase-afgeleide oxidant hypochloreuze zuur (HOCl), PMA, TNFα en IL-8⁶. Hier beschreven is een protocol voor het polariseren van HMDMs op de M1 fenotype en visualiseer de daaropvolgende ONTMOETTE release bij blootstelling aan deze ontstekings stimuli. PMA wordt gebruikt als een stimulans van de release om vergelijkingen te maken met eerdere onderzoeken die neutrofielen hebben gebruikt. Belangrijker, HOCl, IL-8, en TNFα worden ook gebruikt om te stimuleren MET release, die worden verondersteld te zijn betere modellen van de ontstekings omgeving in vivo. De microscopische methode voor visualisatie van ET-release impliceert het extracellulair DNA in levende celculturen met behulp van SYTOX Green, een ondoorlatende fluorescerende groene nucleïnezuur vlek die met succes is toegepast in eerdere neutrofiele onderzoeken. Deze methode maakt een snelle en kwalitatieve beoordeling van de ET-release mogelijk, maar is niet geschikt als een stand-alone methode voor de kwantificering van ET-vrijgave omvang. Er moet een alternatieve methode worden gebruikt als kwantificering nodig is om de mate van ET-afgifte te vergelijken die voortvloeit uit verschillende behandelings condities of interventies.