L'incubazione della paura utilizzando un protocollo esteso di condizionamento della paura per i ratti
Summary
Descriviamo un protocollo esteso di condizionamento della paura che produce sovrallenamento e incubazione della paura nei ratti. Questo protocollo prevede una singola sessione di allenamento con 25 accoppiamenti tono-shock (cioè sovrallenamento) e un confronto delle risposte di congelamento condizionate durante i test di contesto e cue 48 h (a breve termine) e 6 settimane (a lungo termine) dopo l’allenamento.
Abstract
La memoria emotiva è stata studiata principalmente con paradigmi di condizionamento della paura. Il condizionamento della paura è una forma di apprendimento attraverso la quale gli individui imparano le relazioni tra eventi avversi e stimoli altrimenti neutri. Le procedure più utilizzate per studiare i ricordi emotivi comportano il condizionamento della paura nei ratti. In questi compiti, lo stimolo incondizionato (US) è un footshock presentato una o più volte in una o più sessioni, e la risposta condizionata (CR) si sta congelando. In una versione di queste procedure, chiamata condizione della paura cued, un tono (stimolo condizionato, CS) è accoppiato con footshocks (US) durante la fase di allenamento. Durante il primo test, gli animali sono esposti allo stesso contesto in cui si è svolta la formazione e le risposte al congelamento vengono testate in assenza di sferzate e toni (cioè un test di contesto). Durante la seconda prova, il congelamento viene misurato quando il contesto viene modificato (ad esempio, manipolando l’odore e le pareti della camera sperimentale) e il tono viene presentato in assenza di footshocks (cioè una prova di cue). La maggior parte delle procedure di condizionamento della paura cued comportano pochi abbinamenti tono-shock (ad esempio, 1-3 prove in una singola sessione). C’è un crescente interesse per le versioni meno comuni che coinvolgono un ampio numero di abbinamenti (cioè il sovrallenamento) legati all’effetto di lunga durata chiamato incubazione della paura (cioè, le risposte alla paura aumentano nel tempo senza un’ulteriore esposizione a eventi avversivi o stimoli condizionati). I compiti estesi di condizionamento della paura sono stati fondamentali per comprendere gli aspetti comportamentali e neurobiologici dell’incubazione della paura, compresa la sua relazione con altri fenomeni psicologici (ad esempio, disturbo da stress post-traumatico). Qui, descriviamo un protocollo esteso di condizionamento della paura che produce sovrallenamento e incubazione della paura nei ratti. Questo protocollo prevede una singola sessione di allenamento con 25 accoppiamenti tono-shock (cioè sovrallenamento) e un confronto delle risposte di congelamento condizionate durante i test di contesto e cue 48 h (a breve termine) e 6 settimane (a lungo termine) dopo l’allenamento.
Introduction
La memoria è un processo psicologico che comprende diverse fasi: acquisizione di informazioni, consolidamento (consente la stabilità delle informazioni acquisite) e recupero (prova per il processo di consolidamento)1. Durante la fase di consolidamento, si verificano la creazione di nuove connessioni sinaptiche e la modifica delle connessioni preesistenti. Ciò suggerisce la necessità di un periodo di tempo durante il quale si verificano eventi molecolari e fisiologici responsabili diquesti cambiamenti 1,2. Questi cambiamenti fisiologici o molecolari variano se gli eventi recuperati sono emotivamente caricati o meno (cioè la memoria emotiva). Per esempio, la ricerca ha dimostrato che il nucleo laterale e il complesso di amigdala basolaterale sono particolarmente rilevanti per la memoriaemotiva 3,4,5.
I fenomeni di memoria emotiva sono stati studiati principalmente con paradigmi di condizionamentodella paura 5,6. Il condizionamento della paura è una forma di apprendimento attraverso la quale gli individui imparano le relazioni tra eventi avversi e stimoli altrimenti neutri7. I paradigmi di condizionamento della paura producono cambiamenti molecolari, cellulari e strutturali nell’amigdala. Inoltre, il condizionamento della paura modifica la connettività dell’ippocampo durante i processi di consolidamento e recupero della memoria emotiva.
Una delle procedure più comunemente utilizzate per studiare i ricordi di paura è il condizionamento classico (Pavloviano) nei ratti. Questa procedura utilizza in genere footshock (US) come stimolo avverso, che viene consegnato una o più volte in una o più sessioni. La risposta condizionata (CR) dei ratti esposti a questa procedura è il congelamento (cioè ” immobilità generalizzata causata da una risposta tonica generalizzata della muscolatura scheletrica degli animali ad eccezione dei muscoli utilizzati nella respirazione”7 ). Questa risposta potrebbe essere valutata su due tipi di test: test di contesto e cue. Per il test di contesto, il soggetto subisce un determinato numero di footshock durante la sessione di allenamento e quindi viene rimosso dalla camera sperimentale per un periodo di tempo definito. Durante la prova, il soggetto viene riportato nello stesso contesto in cui si è svolta la formazione e vengono raccolte diverse misure di congelamento in assenza di footshock (ad esempio, durata, percentuale o frequenza degli episodi di congelamento) e confrontate con i livelli di base stabiliti durante la fase di allenamento. Per il secondo tipo di test, cue test, uno stimolo (in genere un tono) viene abbinato alle pedonore durante la fase di allenamento (ad esempio, stimolo condizionale, CS). Una volta completata la formazione, l’animale viene rimosso dal contesto di allenamento per un tempo definito e successivamente collocato in un contesto modificato (ad esempio, una camera sperimentale diversa che ha diverse forme di pareti e odore diverso). Il segnale viene quindi presentato un determinato numero di volte e le risposte di congelamento al segnale vengono misurate e confrontate con i livelli di base raccolti durante l’allenamento. La versione più comune di questo paradigma utilizza accoppiamenti tono-shock da 1 a 3 durante una singola sessione di allenamento, seguiti da test di contesto e cue condotti un certo numero di ore o pochi giorni dopo.
Altre procedure di condizionamento della paura attuate meno frequentemente comportano un numero elevato di accoppiamenti shock-cue (cioè prove), che sono state spesso chiamate procedure disovrallenazione 8. Un crescente interesse per questi compiti è legato ai loro effetti di memoria di lunga durata e aumentati chiamati incubazione della paura (cioè, le risposte di paura condizionate aumentano nel tempo in assenza di ulteriore esposizione a eventi avversi o stimoli condizionati)9,10,11. Un esempio di tali procedure di sovrallenazione comporta una fase di formazione di 100 accoppiamenti tono-shock distribuiti in 10 sessioni, seguiti da test di contesto e cue condotti 48 h e 30 giorni dopo11,12. Per evitare un’estesa diffusione di formazione su diversi giorni, Maren (1998) ha riferito che il sovrallenaggio potrebbe essere stabilito e ottimizzato in una singola sessione con 25 accoppiamenti8. L’effetto di incubazione è evidenziato in livelli significativamente più elevati di paura condizionata nei ratti testati 31 giorni dopo l’allenamento, rispetto ai ratti testati 48 h dopo. I compiti estesi di condizionamento della paura sono stati fondamentali per la comprensione degli aspetti comportamentali e neurobiologici alla base dell’incubazione della paura, compresa la sua relazione con altri fenomeni psicologici (ad esempio, disturbo da stress post-traumatico a esordio ritardato)11,12,13.
Qui, descriviamo un protocollo esteso di condizionamento della paura che induce il sovrallenamento e l’incubazione della paura nei ratti. Diverso da altri paradigmi che richiedono diversi giorni di formazione11, il protocollo corrente è focalizzato su una singola sessione di formazione8. Abbiamo usato 25 abbinamenti tono-shock per produrre risposte di congelamento condizionate più elevate durante i test di contesto e cue condotti 6 settimane dopo l’allenamento, rispetto ai test condotti 48 h dopo.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’attuale protocollo esteso di condizionamento della paura è un approccio efficiente e valido per valutare la memoria emotiva in periodi brevi (48 h) e a lungo termine (6 settimane). Così, il protocollo permette di studiare il sovrallenamento e la paura dei fenomeni di incubazione nei ratti. Tra i diversi vantaggi di questo protocollo sono i seguenti. Offre due tipi di test di memoria, vale a dire contesto e cue, che consentono di identificare l’effetto differenziale di due ritardi (48 h e 6 settimane) attraverso le ma…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il sostegno finanziario a questa ricerca è stato fornito da Fundaciàn Universitaria Konrad Lorenz – numero di sovvenzione 9IN15151. Gli autori ringraziano il Dipartimento di Comunicazione dell’Università di Konrad Lorenz per il loro aiuto nella registrazione e nell’editing del video, in particolare Natalia Rivera e Andrés Serrano (Produttori). Inoltre, Nicole Pfaller-Sadovsky e Lucia Medina per i loro commenti sul manoscritto, e Johanna Barrero, Dean presso Corporacion Universitaria Iberoamericana, per la collaborazione istituzionale. Gli autori non hanno conflitti di interesse.
Materials
| Acetic acid (ethanoic acid) | https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/acetic_acid | ||
| Aversive Stimulation Current Package | MED Associates Inc | ENV-420 | https://www.med-associates.com/product/aversive-stimulation-current-test-package/ |
| Contextual test protocol.pro | https://osf.io/4nkfq/?view_only=0640852a88544b239549462f9c21175b. | ||
| Cue test protocol.pro | https://osf.io/4nkfq/?view_only=0640852a88544b239549462f9c21175b. | ||
| Curved Wall Insert | MED Associates Inc | VFC-008-CWI | https://www.med-associates.com/product/curved-wall-insert/ |
| Data processing.zip | https://osf.io/4nkfq/?view_only=0640852a88544b239549462f9c21175b. | ||
| NIR/White Light Control Box | MED Associates Inc | NIR-100 | |
| Pellets | BioServ | F0165 | http://www.bio-serv.com/pdf/F0165.pdf |
| Quick Change Floor/Pan Unit for Mouse | MED Associates Inc | ENV-005FPU-M | https://www.med-associates.com/product/quick-change-floorpan-unit-for-mouse/ |
| Small Tabletop Cabinet and Power Supply | MED Associates Inc | SG-6080D | https://www.med-associates.com/product/small-tabletop-cabinet-and-power-supply-120v-60-hz/ |
| Standalone Aversive Stimulator/Scrambler (115 V / 60 Hz) | MED Associates Inc | ENV-414S | https://www.med-associates.com/product/standalone-aversive-stimulatorscrambler-115-v-ac-60-hz/ |
| Standard Fear Conditioning Chamber | MED Associates Inc | VFC-008 | https://www.med-associates.com/product/standard-fear-conditioning-chamber/ |
| Training protocol VFC.pro | https://osf.io/4nkfq/?view_only=0640852a88544b239549462f9c21175b. | ||
| Video Fear Conditioning Package for Rat | MED Associates Inc | MED-VFC-SCT-R | https://www.med-associates.com/product/nir-video-fear-conditioning-system-for-rat/ |
References
- Frankland, P. W., Bontempi, B. The organization of recent and remote memories. Nature Reviews Neuroscience. 6 (2), 119-130 (2005).
- Suzuki, A., Mukawa, T., Tsukagoshi, A., Frankland, P. W., Kida, S. Activation of LVGCCs and CB1 receptors required for destabilization of reactivated contextual fear memories. Learning & Memory. 15 (6), 426-433 (2008).
- Hermans, E. J., et al. How the amygdala affects emotional memory by altering brain network properties. Neurobiology of Learning and Memory. 112, 2-16 (2014).
- Moryś, J., Berdel, B., Jagalska-Majewska, H., ŁUczyńSka, A. The basolateral amygdaloid complex -its development, morphology and functions. Folia Morphologica. 58 (3), 29-46 (1998).
- LeDoux, J. E. Emotional memory systems in the brain. Behavioural Brain Research. 58 (1-2), 69-79 (1993).
- Labar, K. S. Beyond fear: Emotional memory mechanisms in the human brain. Current Directions in Psychological Science. 16 (4), 173-177 (2007).
- Izquierdo, I., Furini, C. R. G., Myskiw, J. C. Fear Memory. Physiological Reviews. 96 (2), 695-750 (2016).
- Maren, S. Overtraining Does Not Mitigate Contextual Fear Conditioning Deficits Produced by Neurotoxic Lesions of the Basolateral Amygdala. The Journal of Neuroscience. 18 (8), 3097-3097 (1998).
- Pickens, C. L., Golden, S. A., Nair, S. G. Incubation of fear. Current Protocols in Neuroscience. 64, (2013).
- Morrow, J. D., Saunders, B. T., Maren, S., Robinson, T. E. Sign-tracking to an appetitive cue predicts incubation of conditioned fear in rats. Behavioural Brain Research. 276, 59-66 (2015).
- Pickens, C. L., Golden, S. A., Adams-Deutsch, T., Nair, S. G., Shaham, Y. Long-lasting incubation of conditioned fear in rats. Biological Psychiatry. 65 (10), 881-886 (2009).
- Schaap, M. W. H., et al. Nociception and Conditioned Fear in Rats: Strains Matter. PLoS ONE. 8 (12), 83339 (2013).
- Shoji, H., Takao, K., Hattori, S., Miyakawa, T. Contextual and Cued Fear Conditioning Test Using a Video Analyzing System in Mice. Journal of Visualized Experiments. (85), e50871 (2014).
- Patel, T. P., et al. An open-source toolbox for automated phenotyping of mice in behavioral tasks. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, 349 (2014).
- Kabra, M., Robie, A. A., Rivera-Alba, M., Branson, S., Branson, K. JAABA: Interactive machine learning for automatic annotation of animal behavior. Nature Methods. 10 (1), 64-67 (2013).
- Anagnostaras, S. G. Automated assessment of Pavlovian conditioned freezing and shock reactivity in mice using the VideoFreeze system. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 4 (58), (2010).
- Moyer, J. R., Brown, T. H. Impaired Trace and Contextual Fear Conditioning in Aged Rats. Behavioral Neuroscience. 120 (3), 612-624 (2006).
- Schuette, S. R., Hobson, S. Conditioned contextual fear memory to assess natural forgetting and cognitive enhancement in rats. Journal of Biological Methods. 5 (3), 99 (2018).
- Chang, C. H., et al. Fear extinction in rodents. Current Protocols in Neuroscience. , (2009).
- Pickens, C. L., Golden, S. A., Nair, S. G. Incubation of fear. Current Protocols in Neuroscience. 64, 1-18 (2013).
- Izquierdo, I., Furini, C. R. G., Myskiw, J. C. Fear Memory. Physiological Reviews. 96 (2), 695-750 (2016).
- Vetere, G., et al. Chemogenetic Interrogation of a Brain-wide Fear Memory Network in Mice Article Chemogenetic Interrogation of a Brain-wide Fear Memory Network in Mice. Neuron. 94 (2), 363-374 (2017).
- Koob, G. F., Zimmer, A. Chapter 9 – Animal models of psychiatric disorders. Neurobiology of Psychiatric Disorders. 106, 137-166 (2012).
- Bourin, M. Animal models for screening anxiolytic-like drugs: a perspective. Dialogues in clinical neuroscience. 17 (3), 295-303 (2015).
- Murray, S. B., et al. Fear as a translational mechanism in the psychopathology of anorexia nervosa. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 95, 383-395 (2018).
- Pamplona, F. A., et al. Prolonged fear incubation leads to generalized avoidance behavior in mice. Journal of Psychiatric Research. 45 (3), 354-360 (2011).
- Török, B., Sipos, E., Pivac, N., Zelena, D. Modelling posttraumatic stress disorders in animals. Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry. 90, 117-133 (2019).
- Bhakta, A., Gavini, K., Yang, E., Lyman-Henley, L., Parameshwaran, K. Chronic traumatic stress impairs memory in mice: Potential roles of acetylcholine, neuroinflammation and corticotropin releasing factor expression in the hippocampus. Behavioural Brain Research. 335, 32-40 (2017).
- Uniyal, A., et al. Pharmacological rewriting of fear memories: A beacon for post-traumatic stress disorder. European Journal of Pharmacology. , 172824 (2019).
- Barad, M. Fear extinction in rodents: basic insight to clinical promise. Current Opinion in Neurobiology. 15 (6), 710-715 (2005).
- Haaker, J., et al. Making translation work: Harmonizing cross-species methodology in the behavioural neuroscience of Pavlovian fear conditioning. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 107, 329-345 (2019).
- Heroux, N. A., Horgan, C. J., Pinizzotto, C. C., Rosen, J. B., Stanton, M. E. Medial prefrontal and ventral hippocampal contributions to incidental context learning and memory in adolescent rats. Neurobiology of Learning and Memory. 166, 107091 (2019).
- Rossi, M. A., Yin, H. H. Methods for Studying Habitual Behavior in Mice. Current Protocols in Neuroscience. 60 (1), 8-29 (2012).
- Brady, A. M., Floresco, S. B. Operant Procedures for Assessing Behavioral Flexibility in Rats. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
- Zoccolan, D., Di Filippo, A. Methodological Approaches to the Behavioural Investigation of Visual Perception in Rodents. Handbook of Behavioral Neuroscience. , (2018).
- Lguensat, A., Bentefour, Y., Bennis, M., Ba-M’hamed, S., Garcia, R. Susceptibility and Resilience to PTSD-Like Symptoms in Mice Are Associated with Opposite Dendritic Changes in the Prelimbic and Infralimbic Cortices Following Trauma. Neuroscience. 418, 166-176 (2019).
- Li, Q., et al. N-Acetyl Serotonin Protects Neural Progenitor Cells Against Oxidative Stress-Induced Apoptosis and Improves Neurogenesis in Adult Mouse Hippocampus Following Traumatic Brain Injury. Journal of Molecular Neuroscience. 67 (4), 574-588 (2019).
- Pantoni, M. M., Carmack, S. A., Hammam, L., Anagnostaras, S. G. Dopamine and norepinephrine transporter inhibition for long-term fear memory enhancement. Behavioural Brain Research. 378 (112266), 112266 (2020).
- Smith, K. L., et al. Microglial cell hyper-ramification and neuronal dendritic spine loss in the hippocampus and medial prefrontal cortex in a mouse model of PTSD. Brain, Behavior, and Immunity. 80, 889-899 (2019).
- Liu, X., Zheng, X., Liu, Y., Du, X., Chen, Z. Effects of adaptation to handling on the circadian rhythmicity of blood solutes in Mongolian gerbils. Animal Models and Experimental. 2 (2), 127-131 (2019).
- Landgraf, D., McCarthy, M. J., Welsh, D. K. The role of the circadian clock in animal models of mood disorders. Behavioral Neuroscience. 128 (3), 344-359 (2014).
- Refinetti, R., Kenagy, G. J. Diurnally active rodents for laboratory research. Laboratory annimals. 52 (6), 577-587 (2018).
- Hurtado-Parrado, C., et al. Assessing Mongolian gerbil emotional behavior: effects of two shock intensities and response-independent shocks during an extended inhibitory-avoidance task. PeerJ. 5, (2017).
- Frey, P., Eng, S., Gavinf, W. Conditioned suppression in the gerbil. Behavior Research Methods & Instrumentation. 4 (5), 245-249 (1972).
- Woolley, M. L., Haman, M., Higgins, G. A., Ballard, T. M. Investigating the effect of bilateral amygdala lesions on fear conditioning and social interaction in the male Mongolian gerbil. Brain Research. 1078 (1), 151-158 (2006).
- Ballard, T. M., Sänger, S., Higgins, G. a Inhibition of shock-induced foot tapping behaviour in the gerbil by a tachykinin NK1 receptor antagonist. European Journal of Pharmacology. 412 (3), 255-264 (2001).
- Luyten, L., Schroyens, N., Hermans, D., Beckers, T. Parameter optimization for automated behavior assessment: plug-and-play or trial-and-error. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8 (28), (2014).
