Antibiyotik Direnci Platformu Kullanarak Antibiyotik Dereplication

1928 yılında penisilin keşfinden bu yana, çevresel mikroorganizmalardan elde edilen doğal ürünler antimikrobiyal bileşiklerin zengin bir kaynak olduğu kanıtlanmıştır^1. Doğal ürün antibiyotiklerin yaklaşık % 80’i Streptomyces ve diğer aktinomycetes cinsinin bakterilerinden elde edilirken, geri kalan %20’si mantar türleri tarafından üretilmektedir^1. Klinikte β-laktamlar, tetrasiklinler, rifamycins ve aminoglikozitler gibi en yaygın antibiyotik iskelelerinden bazıları başlangıçta mikroplardan izole edilmiştir². Ancak, çoklu ilaca dirençli (MDR) bakterilerin yükselişi nedeniyle, antibiyotik mevcut panel tedavide daha az etkili hale gelmiştir^3,4. Bunlar arasında “ESKAPE” patojenleri (yani vankomisindirençli enterokoklar ve β-laktam dirençli Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, ve Enterobacter sp.), dünya sağlık örgütü 3 gibi büyük halk sağlığı yetkilileri nin en yüksek risk ile ilişkili olduğu düşünülen bakterilerin bir alt kümesi olan^3,4,5. Bu MDR patojenlerinin ortaya çıkması ve küresel yayılması yeni^{antibiyotikler}için sürekli bir ihtiyaç^3,4,5sonuçları . Ne yazık ki, son yirmi yılda mikrobiyal kaynaklardan yeni antibiyotiklerin keşfi giderek zor olduğunu göstermiştir⁶. İlaç keşfi için mevcut yaklaşımlar biyoaktif bileşiklerin yüksek iş gücü tarama dahil, doğal ürün özü kütüphaneler de dahil olmak üzere, belirli bir zamanda test edilecek özleri binlerce izin². Ancak, bir kez antimikrobiyal aktivite tespit edilir, bir sonraki adım aktif bileşeni tanımlamak ve bilinen veya gereksiz bileşikler⁷içeren ortadan kaldırmak için ham özü içeriğini analiz etmektir^{7 ,8}. Bu süreç, dereplication olarak anılacaktır, önlemek ve / veya önemli ölçüde bilinen^{antibiyotiklerin}yeniden keşfi harcanan zamanı azaltmak için hayati önem taşımaktadır 7^,9. Doğal ürün ilaç keşfi gerekli bir adım olmasına rağmen, dereplication kötü üne sahip zahmetli ve kaynak yoğun¹⁰.

Beutler ve ark. ilk dönem “dereplication” icat beri, geniş çabalar bilinen antibiyotiklerin hızlı belirlenmesi için yenilikçi stratejiler geliştirmek için yapılmıştır^11,12. Bugün dereplik için kullanılan en yaygın araçlar yüksek performanslı sıvı kromatografisi, kütle spektrometresi ve nükleer manyetik rezonans tabanlı algılama yöntemleri^11,13gibi analitik kromatografik sistemleri içerir. Ne yazık ki, bu yöntemlerin her biri pahalı analitik ekipman ve sofistike veri yorumu kullanımını gerektirir.

Hızla özel ekipman olmadan yapılabilir bir dereplication yöntemi geliştirmek için bir girişim, biz antibiyotik direnç platformu (ARP)¹⁰kurdu. ARP antibiyotik adjuvants keşfi için kullanılabilir, bilinen direnç mekanizmalarına karşı yeni antibiyotik bileşiklerin profilleme, ve aktinobakteriler ve diğer mikroplardan elde edilen özlerde bilinen antibiyotiklerin derepifasyonu. Burada antibiyotik derepyonu uygulamasına odaklanıyoruz. ARP en sık yeniden keşfedilen antibiyotiklere karşı etkili bireysel direnç genleri ifade izojenik Escherichia coli suşları bir kütüphane kullanır^14,15. E. coli kütüphanesi ikincil bir metabolit üreten organizmanın varlığında büyüdüğünde, bileşiğin kimliği, ilişkili direnç^geniniifade eden E. coli suşlarının büyümesi ile ortaya çıkarılabilir 10 . ARP ilk rapor edildiğinde, kütüphane 16 antibiyotik sınıfına direnç kazandıran >40 genden oluşuyordu. Orijinal dereplication şablonu derepifasyon işlemi sırasında antibiyotik alt sınıf ile ilgili bilgi sağlamak için antibiyotik sınıfı başına direnç genlerinin bir alt kümesini kapsayacak şekilde tasarlanmıştır. Bugün, ARP 18 antibiyotik sınıflarına direnç veren >90 genlerden oluşmaktadır. Direnç genleri bizim geniş koleksiyonu kullanarak, ikincil bir dereplik şablonu geliştirilmiştir ve minimal antibiyotik direnç platformu (MARP) olarak bilinir. Bu şablon, gen artıklığını ortadan kaldırmak ve sadece dereplicated metabolitin ilişkili olduğu genel antibiyotik sınıfı ile ilgili bilgi sağlamak için oluşturuldu. Ayrıca, MARP şablonu hem wildtype ve E. coli BW25113(E. coli BW25133ΔB ΔBΔtolC)bir hiperpermeable / efflux eksik suşu sahip, Sadece ARP orijinal cisimleşme ile karşılaştırıldığında, hiperpermeable suş kullanır. Bu benzersiz yönü dereplik sırasında ek fenotipler oluşturur, Gram-negatif bakterilerin dış membran çapraz bir bileşikler yeteneği gösteren. Burada, ARP ve/veya MARP ile çoğaltma yaparken izlenecek sağlam bir protokolü açıklar, izlenecek en kritik adımları vurgular ve çeşitli olası sonuçları tartışırız.