Desreplicación de antibióticos utilizando la plataforma de resistencia a antibióticos

Desde el descubrimiento de la penicilina en 1928, los productos naturales derivados de microorganismos ambientales han demostrado ser una rica fuente de compuestos antimicrobianos¹. Aproximadamente el 80% de los antibióticos de productos naturales se derivan de bacterias del género Streptomyces y otros actinomycetes, mientras que el 20% restante es producido por las especies de hongos^1. Algunos de los andamios antibiótico más comunes utilizados en la clínica, tales como los lactams, las tetraciclinas, las rifamicinas y los aminoglucósidos, fueron originalmente aislados de los microbios^2. Sin embargo, debido al aumento de las bacterias multirresistentes (MDR), nuestro panel actual de antibióticos se ha vuelto menos eficaz en el tratamiento^3,4. Estos incluyen los patógenos “ESKAPE” (es decir, enterococos resistentes a la vancomicina y Staphylococcus aureusresistentes a la lactam, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii,y Enterobacter sp.), que son un subconjunto de bacterias consideradas asociadas al mayor riesgo por una serie de importantes autoridades de salud pública como la Organización Mundial de la Salud^3,4,5. La aparición y propagación global de estos patógenos MDR da lugar a una necesidad constante de nuevos antibióticos^3,4,5. Lamentablemente, las últimas dos décadas han demostrado que el descubrimiento de nuevos antibióticos de fuentes microbianas es cada vez más difícil⁶. Los enfoques actuales para el descubrimiento de fármacos incluyen el cribado de alto rendimiento de compuestos bioactivos, incluidas las bibliotecas de extractos de productos naturales, lo que permite probar miles de extractos en un momento dado^2. Sin embargo, una vez detectada la actividad antimicrobiana, el siguiente paso es analizar el contenido del extracto crudo para identificar el componente activo y eliminar aquellos que contienen compuestos conocidos o redundantes^7,8. Este proceso, conocido como desreplicación, es vital para prevenir y/o reducir significativamente el tiempo dedicado al redescubrimiento de antibióticos conocidos^7,9. Aunque es un paso necesario en el descubrimiento de fármacos de productos naturales, la dereplicación es notoriamente laboriosa y requiere muchos recursos¹⁰.

Desde que Beutler y otros acuñaron por primera vez el término “desreplicación”, se han realizado amplios esfuerzos para desarrollar estrategias innovadoras para la rápida identificación de antibióticos conocidos^11,12. Hoy en día, las herramientas más comunes utilizadas para la desreplicación incluyen sistemas cromatográficos analíticos como cromatografía líquida de alto rendimiento, espectrometría de masas y métodos de detección basados en resonancia magnética nuclear^11,13. Desafortunadamente, cada uno de estos métodos requiere el uso de costosos equipos analíticos y una sofisticada interpretación de datos.

En un intento de desarrollar un método de desreplicación que se puede realizar rápidamente sin equipo especializado, establecimos la plataforma de resistencia a antibióticos (ARP)¹⁰. El ARP se puede utilizar para el descubrimiento de adyuvantes antibióticos, la elaboración de perfiles de nuevos compuestos antibióticos contra mecanismos de resistencia conocidos, y la dereplicación de antibióticos conocidos en extractos derivados de actinobacterias y otros microbios. Aquí, nos centramos en su aplicación en la dereplicación de antibióticos. El ARP utiliza una biblioteca de cepas isogénicas de Escherichia coli que expresan genes de resistencia individuales que son eficaces contra los antibióticos más comúnmente redescubiertos^14,15. Cuando la biblioteca de E. coli se cultiva en presencia de un organismo secundario productor de metabolitos, la identidad del compuesto puede deducirse por el crecimiento de cepas de E. coli que expresan su gen de resistencia asociado¹⁰. Cuando se informó por primera vez de la ARP, la biblioteca consistió en >40 genes que confieren resistencia a 16 clases de antibióticos. La plantilla de desreplicación original fue diseñada para abarcar un subconjunto de genes de resistencia por clase de antibióticos para proporcionar información sobre la subclase de antibióticos durante el proceso de desreplicación. Hoy en día, la ARP se compone de >90 genes que confieren resistencia a 18 clases de antibióticos. Utilizando nuestra extensa colección de genes de resistencia, se ha desarrollado una plantilla de desreplicación secundaria que se conoce como la plataforma de resistencia mínima a los antibióticos (MARP). Esta plantilla fue creada para eliminar la redundancia genética y simplemente proporcionar información sobre la clase general de antibióticos con la que está relacionado un metabolito desreplicado. Además, la plantilla MARP posee tanto el tipo salvaje como una cepa deficiente hiperpermeable/eflujo de E. coli BW25113 (E. coli BW25113 –bamB–tolC),en comparación con la encarnación original de la ARP, que sólo utiliza la cepa hiperpermeable. Este aspecto único crea fenotipos adicionales durante la dereplicación, lo que indica una capacidad de compuestos para cruzar la membrana externa de las bacterias Gram-negativas. Aquí, describimos un protocolo robusto a seguir al dereplicar con el ARP y/o MARP, resaltamos los pasos más críticos a seguir, y discutimos los diversos resultados posibles.