Desreferência antibiótica usando a plataforma de resistência a antibióticos

Desde a descoberta da penicilina em 1928, os produtos naturais derivados de microrganismos ambientais provaram ser uma fonte rica de compostos antimicrobianos¹. Aproximadamente 80% dos antibióticos do produto natural são derivados de bactérias do gênero Streptomyces e outros Actinomycetes, enquanto os 20% restantes são produzidos por espécies fúngicas¹. Alguns dos andaimes antibióticos mais comuns utilizados na clínica, como os β-lactams, tetraciclinas, rifamicinas e aminoglicosídeos, foram originalmente isolados de micróbios². No entanto, devido ao surgimento de bactérias multirresistentes (MDR), nosso atual painel de antibióticos tornou-se menos eficaz no tratamento^3,4. Estes incluem os patógenos “ESKAPE” (i.e., enterococos resistentes à vancomicina e Staphylococcus aureusresistentes a β-lactâmicos, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumanniie Enterobacter SP.), que são um subconjunto de bactérias consideradas associadas ao maior risco por um número de grandes autoridades de saúde pública, como a Organização Mundial da saúde^3,4,5. O surgimento e a disseminação global desses patógenos do MDR resultam em uma necessidade constante de novos antibióticos^3,4,5. Lamentavelmente, as duas últimas décadas demonstraram que a descoberta de novos antibióticos a partir de fontes microbianas é cada vez mais difícil⁶. As abordagens atuais para a descoberta de drogas incluem a triagem de alto débito de compostos bioativos, incluindo bibliotecas de extração de produtos naturais, permitindo que milhares de extratos sejam testados em um determinado momento². No entanto, uma vez detectada a atividade antimicrobiana, o próximo passo é analisar o conteúdo do extrato bruto para identificar o componente ativo e eliminar aqueles que contenham compostos conhecidos ou redundantes^7,8. Este processo, referido como dereplication, é vital para prevenir e/ou reduzir significativamente o tempo gasto na redescoberta de antibióticos conhecidos^7,9. Embora um passo necessário na descoberta de medicamentos de produto natural, a desreferência é notoriamente trabalhosa e intensiva de recursos¹⁰.

Desde que Beutler et al. primeiro cunhou o termo “dereplicação”, esforços extensivos têm sido feitos para desenvolver estratégias inovadoras para a rápida identificação de antibióticos conhecidos^11,12. Hoje, as ferramentas mais comuns utilizadas para a dereplicação incluem sistemas cromatográficos^{analíticos, como}cromatografia líquida de alta eficiência, espectrometria de massas e métodos de detecção baseados em ressonância magnética nuclear^11,13. Infelizmente, cada um desses métodos requer o uso de equipamentos analíticos caros e interpretação de dados sofisticados.

Na tentativa de desenvolver um método de desreferência que pode ser realizado rapidamente sem equipamento especializado, estabelecemos a plataforma de resistência a antibióticos (ARP)¹⁰. O ARP pode ser usado para a descoberta de adjuvantes antibióticos, o perfilamento de novos compostos antibióticos contra mecanismos de resistência conhecidos, e a desreferência de antibióticos conhecidos em extratos derivados de actinobactérias e outros micróbios. Aqui, nós nos concentramos em sua aplicação na dereplicação de antibióticos. O ARP utiliza uma biblioteca de cepas isogênicas de Escherichia coli expressando genes de resistência individuais que são eficazes contra os antibióticos mais comumente redescobertos^14,15. Quando a biblioteca de e. coli é cultivada na presença de um organismo produtor de metabolito secundário, a identidade do composto pode ser deduzada pelo crescimento de cepas de e. coli que expressam seu gene de resistência associado¹⁰. Quando o ARP foi relatado pela primeira vez, a biblioteca consistiu em > 40 genes conferindo resistência a 16 classes de antibióticos. O modelo de dereplicação original foi projetado para abranger um subconjunto de genes de resistência por classe antibiótica para fornecer informações sobre subclasse antibiótica durante o processo de desreferência. Hoje, o ARP é compreendido de > 90 genes que conferem a resistência a 18 classes antibióticas. Usando nossa extensa coleção de genes de resistência, um modelo de dereplicação secundária foi desenvolvido e é conhecido como a plataforma mínima de resistência a antibióticos (MARP). Este modelo foi criado para eliminar a redundância genética e simplesmente fornecer informações sobre a classe geral de antibióticos que um metabolito dereplicated está relacionado. Adicionalmente, o modelo de MARP possui o tipo selvagem e uma tensão deficiente hyperpermeable/efflux de e. coli BW25113 (e. coli BW25113 δBAMBδTolc), comparado à encarnação original do ARP, que somente utiliza a estirpe hiperpermeável. Este aspecto único cria fenótipos adicionais durante a dereplicação, indicando uma capacidade de compostos para atravessar a membrana externa de bactérias Gram-negativas. Aqui, nós descrevemos um protocolo robusto a ser seguido quando dereplicating com o ARP e/ou o MARP, realça as etapas as mais críticas a ser seguidas, e discute os vários resultados possíveis.