Dereplication antibiotico utilizzando la piattaforma di resistenza agli antibiotici

Dalla scoperta della penicillina nel 1928, i prodotti naturali derivati da microrganismi ambientali hanno dimostrato di essere una ricca fonte di composti antimicrobici¹. Circa l’80% degli antibiotici del prodotto naturale sono derivati da batteri del genere Streptomyces e altri actinomycetes, mentre il restante 20% è prodotto da specie fungine¹. Alcuni degli scaffold antibiotici più comuni utilizzati nella clinica, come i lactam, le tetracicline, i rifamycin e gli amminocolici, erano originariamente isolati dai microbi². Tuttavia, a causa dell’aumento dei batteri multifarmacoresistenti (MDR), il nostro attuale gruppo di antibiotici è diventato meno efficace nel trattamento^3,4. Questi includono gli agenti patogeni “ESKAPE” (cioè enterococci resistenti alla vancomicina e Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinebacter baumannii, e Enterobacter sp.), che sono un sottoinsieme di batteri ritenuti associati al più alto rischio da un certo numero di importanti autorità sanitarie pubbliche come l’Organizzazione Mondiale della Sanità^3,4,5. L’emergere e la diffusione globale di questi patogeni MDR si traduce in un costante bisogno di nuovi antibiotici^3,4,5. Purtroppo, gli ultimi due decenni hanno dimostrato che la scoperta di nuovi antibiotici da fonti microbiche è sempre più difficile⁶. Gli attuali approcci alla scoperta di farmaci includono lo screening ad alto consumo di composti bioattivi, comprese le librerie di estratti di prodotto naturali, consentendo il test di migliaia di estratti in un dato momento². Tuttavia, una volta rilevata l’attività antimicrobica, il passo successivo è quello di analizzare il contenuto dell’estratto grezzo per identificare il componente attivo ed eliminare quelli che contengono composti noti o ridondanti^7,8. Questo processo, denominato dereplicare, è fondamentale per prevenire e/o ridurre significativamente il tempo dedicato alla riscoperta di antibiotici noti^7,9. Anche se un passo necessario nella scoperta di farmaci di prodotto naturale, dereplication è notoriamente laborioso e ad alta intensità di^{risorse 10}.

Da quando Beutler et al. per la prima volta ha coniato il termine “dereplication”, sono stati fatti sforzi ampi per sviluppare strategie innovative per la rapida identificazione degli antibiotici noti^11,12. Oggi gli strumenti più comuni utilizzati per la dereplicazione includono sistemi cromatografici analitici come la cromatografia liquida ad alte prestazioni, la spettrometria di massa e i metodi di rilevamento basato sulla risonanza magnetica nucleare^11,13. Purtroppo, ognuno di questi metodi richiede l’uso di costose apparecchiature analitiche e un’interpretazione sofisticata dei dati.

Nel tentativo di sviluppare un metodo di dereplicazione che può essere eseguito rapidamente senza attrezzature specializzate, abbiamo stabilito la piattaforma di resistenza agli antibiotici (ARP)¹⁰. L’ARP può essere utilizzato per la scoperta di adiuvanti antibiotici, la profilazione di nuovi composti antibiotici contro meccanismi di resistenza noti e la dereplicazione di antibiotici noti in estratti derivati da actinobatteri e altri microbi. Qui, ci concentriamo sulla sua applicazione nella dereplicazione antibiotica. L’ARP utilizza una libreria di ceppi isogenici di Escherichia coli che esprimono singoli geni di resistenza che sono efficaci contro gli antibiotici più comunemente riscoperti^14,15. Quando la biblioteca E. coli viene coltivata in presenza di un organismo secondario che produce metaboliti, l’identità del composto può essere dedotta dalla crescita di ceppi di E. coli che esprimono il suo gene di resistenza associato¹⁰. Quando l’ARP è stato segnalato per la prima volta, la biblioteca consisteva di >40 geni che conferevano resistenza a 16 classi di antibiotici. Il modello originale di dereplicazione è stato progettato per comprendere un sottoinsieme di geni della resistenza per classe di antibiotici per fornire informazioni riguardanti la sottoclasse di antibiotici durante il processo di dereplicazione. Oggi, l’ARP è composto da >90 geni che conferiscono resistenza a 18 classi di antibiotici. Utilizzando la nostra vasta collezione di geni di resistenza, è stato sviluppato un modello di dereplicazione secondario ed è noto come la piattaforma di resistenza agli antibiotici minima (MARP). Questo modello è stato creato per eliminare la ridondanza genica e per fornire semplicemente informazioni riguardanti la classe antibiotica generale a cui è correlato un metabolita. Inoltre, il modello MARP possiede sia wildtype che un ceppo iperpermeabile/efflusso carente di E. coli BW25113(E. coli BW25113 –bam B–tolC), rispetto all’incarnazione originale dell’ARP, che solo utilizza il ceppo iperpermeabile. Questo aspetto unico crea fenotipi aggiuntivi durante la dereplicazione, indicando una capacità di composti di attraversare la membrana esterna dei batteri Gram-negativi. Qui, descriviamo un protocollo robusto da seguire quando descriviamo con l’ARP e/o la MARP, evidenziamo i passaggi più critici da seguire e discutiamo i vari possibili risultati.