Antibiotika-Dereplikation mit der Antibiotikaresistenzplattform

Seit der Entdeckung von Penicillin im Jahr 1928 haben sich natürliche Produkte aus Umweltmikroorganismen als reiche Quelle antimikrobieller Verbindungen erwiesen¹. Ungefähr 80% der Natürlichen Produkte Antibiotika werden von Bakterien der Gattung Streptomyces und anderen Actinomycetes abgeleitet, während die restlichen 20% von Pilzarten produziert werden¹. Einige der häufigsten Antibiotika-Gerüste, die in der Klinik verwendet werden, wie die Lactams, Tetracycline, Rifamycine und Aminoglykoside, wurden ursprünglich aus Mikroben isoliert². Aufgrund des Anstiegs von multiresistenten (MDR) Bakterien ist unser aktuelles Antibiotika-Panel in der Behandlung^3,4weniger wirksam geworden. Dazu gehören die “ESKAPE”-Erreger (d.h. vancomycinresistente Enterokokken und Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, und Enterobacter sp.), die eine Teilmenge von Bakterien sind, die von einer Reihe wichtiger Gesundheitsbehörden wie der Weltgesundheitsorganisation^3,4,5als mit dem höchsten Risiko assoziiert angesehen werden. Das Aufkommen und die weltweite Ausbreitung dieser MDR-Erreger führen zu einem konstanten Bedarf an neuartigen Antibiotika^3,4,5. Bedauerlicherweise haben die letzten zwei Jahrzehnte gezeigt, dass die Entdeckung neuartiger Antibiotika aus mikrobiellen Quellen immer schwieriger wird⁶. Aktuelle Ansätze zur Arzneimittelentdeckung umfassen das Hochdurchsatz-Screening von bioaktiven Verbindungen, einschließlich Natürlicherextraktbibliotheken, so dass Tausende von Extrakten zu einem bestimmten Zeitpunkt getestet werden können². Sobald jedoch antimikrobielle Aktivität erkannt wird, besteht der nächste Schritt darin, den Inhalt des Rohextrakts zu analysieren, um die aktive Komponente zu identifizieren und diejenigen zu beseitigen, die bekannte oder redundante Verbindungen enthalten^7,8. Dieser Prozess, der als Dereplikation bezeichnet wird, ist von entscheidender Bedeutung, um die Zeit, die für die Wiederentdeckung bekannter Antibiotika aufgewendet wird, zu verhindern und/oder erheblich zu reduzieren^7,9. Obwohl ein notwendiger Schritt in der Entdeckung von Naturprodukten, Ist die Dereplikation notorisch mühsam und ressourcenintensiv¹⁰.

Seit Beutler et al. den Begriff “Dereplikation” erstmals geprägt haben, wurden umfangreiche Anstrengungen unternommen, um innovative Strategien zur schnellen Identifizierung bekannter Antibiotika zu entwickeln^11,12. Heute sind die häufigsten Werkzeuge für die Dereplikation analytische chromatographische Systeme wie Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie, Massenspektrometrie und Kernspinresonanz-basierte Detektionsmethoden^11,13. Leider erfordert jede dieser Methoden den Einsatz teurer Analysegeräte und ausgeklügelter Dateninterpretation.

In dem Versuch, eine Dereplikationsmethode zu entwickeln, die schnell ohne spezielle Ausrüstung durchgeführt werden kann, haben wir die Antibiotikaresistenzplattform (ARP)¹⁰eingerichtet. Die ARP kann für die Entdeckung von Antibiotika-Adjuvantien, die Profilierung neuer Antibiotika-Verbindungen gegen bekannte Resistenzmechanismen und die Dereplikation bekannter Antibiotika in Extrakten aus Aktinobakterien und anderen Mikroben verwendet werden. Hier konzentrieren wir uns auf seine Anwendung bei der Dereplikation von Antibiotika. Die ARP nutzt eine Bibliothek von isogenen Escherichia coli-Stämmen, die individuelle Resistenzgene exdrücken, die gegen die am häufigsten wiederentdeckten Antibiotika^14,15wirksam sind. Wenn die E. coli-Bibliothek in Gegenwart eines sekundären Metaboliten produzierenden Organismus angebaut wird, kann die Identität der Verbindung durch das Wachstum von E. coli-Stämmen abgeleitet werden, die das zugehörige Resistenzgen¹⁰ausdrücken. Als die ARP zum ersten Mal gemeldet wurde, bestand die Bibliothek aus >40 Genen, die eine Resistenz für 16 Antibiotikaklassen verliehen. Die ursprüngliche Dereplikationsvorlage wurde entwickelt, um eine Teilmenge von Resistenzgenen pro Antibiotikaklasse zu umfassen, um Informationen über die Unterklasse von Antibiotika während des Dereplikationsprozesses bereitzustellen. Heute besteht die ARP aus >90 Genen, die 18 Antibiotikaklassen Resistenzen verleihen. Mit unserer umfangreichen Sammlung von Resistenzgenen wurde eine sekundäre Dereplikationsvorlage entwickelt, die als minimale Antibiotikaresistenzplattform (MARP) bekannt ist. Diese Vorlage wurde erstellt, um Genredundanz zu beseitigen und einfach Informationen über die allgemeine Antibiotikaklasse bereitzustellen, mit der ein dereplizierter Metabolit verwandt ist. Darüber hinaus besitzt die MARP-Vorlage sowohl Wildtyp als auch einen hyperpermeablen/efflux-defizienten Stamm von E. coli BW25113 (E. coli BW25113 nutzt die hyperpermeable Sorte. Dieser einzigartige Aspekt erzeugt zusätzliche Phänotypen während der Dereplikation, was auf eine Verbindungen Fähigkeit, die äußere Membran von Gram-negativen Bakterien zu überqueren. Hier beschreiben wir ein robustes Protokoll, das bei der Dereplikation mit dem ARP und/oder MARP zu befolgen ist, heben die wichtigsten Schritte hervor, die befolgt werden müssen, und besprechen die verschiedenen möglichen Ergebnisse.