Déplication d'antibiotiques à l'aide de la plate-forme de résistance aux antibiotiques

Depuis la découverte de la pénicilline en 1928, les produits naturels dérivés de micro-organismes environnementaux se sont avérés être une riche source de composés antimicrobiens¹. Environ 80% des antibiotiques de produits naturels sont dérivés de bactéries du genre Streptomyces et d’autres actinomycéres, tandis que les 20% restants sont produits par des espèces fongiques¹. Certains des échafaudages antibiotiques les plus courants utilisés dans la clinique, tels que les lactams, les tétracyclines, les rifamycines et les aminoglycosides, ont été isolés à l’origine à partir de microbes². Cependant, en raison de l’augmentation des bactéries multirésistantes (MDR), notre panel actuel d’antibiotiques est devenu moins efficace dans le traitement^3,4. Il s’agit notamment des agents pathogènes “ESKAPE” (c.-à-d., entérocoques résistants à la vancomycine et Staphylococcus aureusrésistant au lactam , Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, et Enterobacter sp.), qui sont un sous-ensemble de bactéries considérées comme associées au risque le plus élevé par un certain nombre de grandes autorités de santé publique telles que l’Organisation mondiale de la Santé^3,4,5. L’émergence et la propagation mondiale de ces agents pathogènes MDR entraîne un besoin constant d’antibiotiques nouveaux^3,4,5. Malheureusement, les deux dernières décennies ont démontré que la découverte de nouveaux antibiotiques provenant de sources microbiennes est de plus en plus difficile⁶. Les approches actuelles de la découverte de médicaments comprennent le dépistage à haut débit des composés bioactifs, y compris les bibliothèques d’extraits de produits naturels, permettant de tester des milliers d’extraits à un moment donné². Cependant, une fois que l’activité antimicrobienne est détectée, l’étape suivante consiste à analyser le contenu de l’extrait brut afin d’identifier la composante active et d’éliminer ceux qui contiennent des composés connus ou redondants^7,8. Ce processus, appelé déplication, est essentiel pour prévenir et/ou réduire considérablement le temps consacré à la redécouverte d’antibiotiques connus^7,9. Bien qu’une étape nécessaire dans la découverte de médicaments de produits naturels, la déplication est notoirement laborieuse et gourmande en ressources¹⁰.

Depuis que Beutler et coll. ont inventé le terme « déplication », des efforts considérables ont été déployés pour élaborer des stratégies novatrices pour l’identification rapide des antibiotiques connus^11,12. Aujourd’hui, les outils les plus communs utilisés pour la déplication incluent les systèmes chromatographiques analytiques tels que la chromatographie liquide de haute performance, la spectrométrie de masse, et les méthodes de détection par résonance magnétique nucléaire^11,13. Malheureusement, chacune de ces méthodes nécessite l’utilisation d’équipements d’analyse coûteux et d’une interprétation sophistiquée des données.

Dans une tentative de développer une méthode de déplication qui peut être rapidement effectuée sans équipement spécialisé, nous avons établi la plate-forme de résistance aux antibiotiques (ARP)¹⁰. L’ARP peut être utilisé pour la découverte d’adjuvants antibiotiques, le profilage de nouveaux composés antibiotiques contre les mécanismes de résistance connus, et la déplication d’antibiotiques connus dans des extraits dérivés d’actinobactéries et d’autres microbes. Ici, nous nous concentrons sur son application dans la déplication d’antibiotiques. L’ARP utilise une bibliothèque de souches isogènes Escherichia coli exprimant des gènes de résistance individuels qui sont efficaces contre les antibiotiques les plus couramment redécouverts^14,15. Lorsque la bibliothèque E. coli est cultivée en présence d’un organisme secondaire producteur de métabolites, l’identité du composé peut être déduite par la croissance des souches d’E. coli qui expriment son gène de résistance associé¹⁰. Lorsque l’ARP a été signalé pour la première fois, la bibliothèque se composait de gènes de 40 livres conférant une résistance à 16 classes d’antibiotiques. Le modèle original de déplication a été conçu pour englober un sous-ensemble de gènes de résistance par classe d’antibiotiques pour fournir des informations concernant la sous-classe d’antibiotiques pendant le processus de déplication. Aujourd’hui, l’ARP est composé de gènes qui confèrent une résistance à 18 classes d’antibiotiques. À l’aide de notre vaste collection de gènes de résistance, un modèle de déplication secondaire a été développé et est connu sous le nom de plate-forme minimale de résistance aux antibiotiques (MARP). Ce modèle a été créé pour éliminer la redondance génétique et pour simplement fournir des informations concernant la classe générale d’antibiotiques qu’un métabolite déreproduit est lié à. En outre, le modèle MARP possède à la fois wildtype et une souche hyperperméable / efflux déficiente de E. coli BW25113 (E. coli BW25113 –bamB–tolC), par rapport à l’incarnation originale de l’ARP, qui ne utilise la souche hyperperméable. Cet aspect unique crée des phénotypes supplémentaires pendant la déplication, indiquant une capacité de composés à traverser la membrane externe des bactéries Gram-négatives. Ici, nous décrivons un protocole robuste à suivre lors de la déplication avec l’ARP et/ou le MARP, mettons en évidence les étapes les plus critiques à suivre, et discutons des divers résultats possibles.