Antibiotica-Dereplicatie met behulp van het antibioticumresistentie platform

Sinds de ontdekking van penicillaire in 1928, natuurlijke producten afgeleid van milieu-micro-organismen hebben bewezen een rijke bron van antimicrobiële verbindingen¹. Ongeveer 80% van de antibiotica van het natuurlijke product zijn afgeleid van bacteriën van het geslacht Streptomyces en andere Actinomyceten, terwijl de resterende 20% wordt geproduceerd door schimmelsoorten¹. Enkele van de meest voorkomende antibiotica-steigers die in de kliniek worden gebruikt, zoals de β-lactams, tetracyclines, rifamycinen en aminoglycosiden, werden oorspronkelijk geïsoleerd van microben². Vanwege de opkomst van multiresistente (MDR) bacteriën is ons huidige panel van antibiotica echter minder effectief geworden in de behandeling van^3,4. Deze omvatten de “eskape” pathogenen (d.w.z. vancomycine-resistente enterokokken en β-lactam-resistente Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, en Enterobacter SP.), een subset van bacteriën die geacht worden geassocieerd te worden met het hoogste risico door een aantal grote volksgezondheidsinstanties zoals de Wereldgezondheidsorganisatie^3,4,5. De opkomst en wereldwijde verspreiding van deze MDR-pathogenen resulteert in een constante behoefte aan nieuwe antibiotica^3,4,5. Helaas hebben de voorbije twintig jaar aangetoond dat de ontdekking van nieuwe antibiotica uit microbiële bronnen steeds moeilijker wordt⁶. Huidige benaderingen van Drug Discovery omvatten de hoge doorvoer screening van bioactieve verbindingen, met inbegrip van natuurlijke product extract Bibliotheken, waardoor duizenden extracten worden getest op een gegeven moment². Echter, zodra antimicrobiële activiteit wordt gedetecteerd, de volgende stap is het analyseren van de inhoud van het ruwe extract om de actieve component te identificeren en elimineren die met bekende of redundante verbindingen^7,8. Dit proces, “dereplication” genoemd, is van vitaal belang om de tijd die aan de herontdekking van bekende antibiotica^7,9wordt besteed, te voorkomen en/of aanzienlijk te verkorten. Hoewel een noodzakelijke stap in het opsporen van natuurlijke geneesmiddelen, dereplication is berukker bewerkelijk en resource-intensieve¹⁰.

Sinds Beutler et al. eerst bedacht de term “dereplication”, uitgebreide inspanningen zijn gedaan om innovatieve strategieën voor de snelle identificatie van bekende antibiotica te ontwikkelen^11,12. Vandaag de dag zijn de meest gebruikte instrumenten voor dereplicatie analytische chromatografische systemen zoals krachtige vloeistofchromatografie, massaspectrometrie en op nucleaire magnetische resonantie gebaseerde detectiemethoden^11,13. Helaas vereist elk van deze methoden het gebruik van dure analytische apparatuur en geavanceerde gegevens interpretatie.

In een poging om een dereplication methode te ontwikkelen die snel kan worden uitgevoerd zonder gespecialiseerde apparatuur, hebben we het antibioticum Resistance platform (ARP)¹⁰opgericht. De ARP kan worden gebruikt voor de ontdekking van antibiotica-adjuvantia, de profilering van nieuwe antibiotica verbindingen tegen bekende resistentiemechanismen en de dereplicatie van bekende antibiotica in extracten afkomstig van actinobacteriën en andere microben. Hier, we richten ons op de toepassing ervan in antibioticum dereplication. De ARP gebruikt een bibliotheek van isogene Escherichia coli stammen die individuele resistentiegenen uitdrukken die effectief zijn tegen de meest in het algemeen opnieuw ontdekte antibiotica^14,15. Wanneer de E. coli bibliotheek wordt geteeld in aanwezigheid van een secundaire metaboliet-producerende organisme, de identiteit van de compound kan worden afgeleid door de groei van e. coli stammen die de bijbehorende weerstand gen¹⁰uitdrukken. Toen de ARP voor het eerst werd gerapporteerd, bestond de bibliotheek uit > 40 genen die resistentie tegen 16 antibiotica klassen verlenen. De oorspronkelijke dereplication template is ontworpen om een subset van resistentiegenen per antibiotica klasse te omvatten om informatie te verstrekken over antibiotica subklasse tijdens het dereplication proces. Tegenwoordig bestaat de ARP uit > 90 genen die resistentie verlenen aan 18 antibiotica klassen. Met behulp van onze uitgebreide collectie van resistentiegenen is een secundair dereplication template ontwikkeld en staat bekend als het minimale antibiotica Resistance platform (MARP). Deze sjabloon is gemaakt om te elimineren van Gene redundantie en eenvoudig informatie te verstrekken over de algemene antibiotica klasse die een dereplicated metaboliet is gerelateerd aan. Daarnaast bezit het MARP-template zowel wild type als een hyperpermeabele/effluxdeficiënte stam van e. coli BW25113 (E. coli BW25113 δBAMBδtolc), vergeleken met de oorspronkelijke incarnatie van de ARP, die alleen maakt gebruik van de hyperpermeabele stam. Dit unieke aspect creëert extra fenotypes tijdens dereplicatie, wat duidt op een verbindingen vermogen om het buitenste membraan van gram-negatieve bacteriën over te steken. Hier beschrijven we een robuust protocol dat moet worden gevolgd bij het derepliceren met ofwel de ARP en/of MARP, Markeer de meest kritieke stappen die moeten worden gevolgd, en bespreek de verschillende mogelijke uitkomsten.