Imaging Dpp Liberación de un disco de ala Drosophila

Las proteínas morfogenéticas óseas (BMP) son esenciales para la embriogénesis temprana y el patrón de las estructuras adultas. Los BMP se producen y secretan para afectar la transcripción de los genes diana necesarios para el crecimiento y la diferenciación celular en las células que responden. Decapentaplegic (Dpp) es un homólogo Drosophila de BMP4 que es importante para el desarrollo de estructuras embrionarias y adultas como el ala^1,2,3,4. Varios grupos se han centrado en el papel de Dpp en el patrón de las alas de mosca adultas porque 1) las alas se componen de dos hojas de epitelia transparente con un patrón de venación consistente que se puede evaluar fácilmente; 2) los discos de alas también son razonablemente planos, se pueden cultivar fuera de la larva, y son fáciles de imaginar y cuantificar las diferencias en el patrón; y 3) el desarrollo del patrón de ala es sensible a Dpp de tal manera que pequeñas perturbaciones en la vía afectarán el patrón de venación del ala.

Dpp se produce en celdas situadas en el límite anterior/posterior del disco de ala^5,6,7,8. Dpp se une a un complejo de tipo 1 y tipo 2 receptores de serina/threonina quinasa^9,10. Tras la unión Dpp, el receptor tipo 2 fosforila el receptor tipo 1 que luego fosforila a las madres contra Dpp (Mad), un homólogo Smad 1/5/8. Phosphorylated SMAD recluta un co-Smad adicional (Medea), que le permite entrar al núcleo donde regula los genes diana, dando lugar a efectos aguas abajo como la proliferación o diferenciación^4,11.

Recientemente, el Bates Lab ha demostrado que la liberación incorrecta de Dpp dentro del disco del ala puede conducir a una disminución en la fosforilación Mad, reducción en la expresión génica objetivo, y defectos de patrón de ala^12,13. Varios canales iónicos impactan el desarrollo del ala Drosophila y las estructuras asociadas^14,15. Estos canales iónicos también podrían estar involucrados en la versión Dpp. Al determinar el mecanismo de liberación de morógeno, es importante que haya un método para visualizar eventos de liberación.

Los doctores Aurelio Teleman y Stephen Cohen crearon una proteína de fusión Dpp-GFP que es capaz de rescatar la pérdida de Dpp, lo que significa que es biológicamente activa y se libera de una manera biológicamente relevante^16. Aquí, describimos cómo visualizamos los eventos de lanzamiento de Dpp usando este Dpp-GFP. Esta proteína de fusión es particularmente útil porque GFP es sensible al pH de tal manera que cuando está en vesículas ácidas, la fluorescencia se afeita¹⁷. Por lo tanto, cuando una proteína etiquetada con GFP se libera de una vesícula en el entorno extracelular más neutro, la intensidad de la fluorescencia de GFP aumenta¹⁷. Aprovechamos la sensibilidad al pH de GFP para determinar si Dpp-GFP reside en vesículas ácidas. Hemos dado imágenes de discos de ala que expresan Dpp-GFP antes y después de la adición de cloruro de amonio, que neutraliza las vesículas de los compartimentos intracelulares¹⁸. Encontramos un aumento significativo en la fluorescencia de puncta después de la adición de cloruro de amonio, lo que sugiere que el Dpp-GFP intracelular se apadece antes de la adición de cloruro de amonio¹⁸. Concluimos que el Dpp-GFP intracelular reside en compartimentos ácidos ligados a la membrana, como vesículas, y no se quega al adicionar cloruro de amonio para neutralizar el pH de los compartimentos intracelulares¹⁸. Esto hace que la imagen en vivo de Dpp-GFP sea una técnica útil para visualizar la dinámica de Dpp en el disco de ala Drosophila a medida que se libera de los compartimentos ácidos en el entorno extracelular.

Aquí, describimos el método que usamos para visualizar eventos de lanzamiento de Dpp mediante Dpp-GFP. Dpp-GFP se puede expresar en su patrón nativo en discos de ala Drosophila utilizando el sistema UAS-GAL4¹⁹. Este es el método que se utilizó para determinar que los canales Irk afectan a la versión¹⁸de Dpp. Validamos el método mediante pilas z de imágenes en vivo. No vemos Dpp-GFP puncta moviéndose dentro del plano de enfoque en series temporales si adquirimos en un plano de enfoque. Tampoco vemos el movimiento de Dpp-GFP puncta si pusimos una imagen en una pila z. Concluimos que el Puncta Dpp-GFP visto usando este método son eventos de liberación en lugar de movimiento de vesículas intracelularmente. Este método de imagen en vivo de Dpp-GFP podría utilizarse potencialmente para probar otros modificadores putativos de la liberación de Dpp para su impacto en la dinámica de Dpp o podría ser modificado para mirar la dinámica de otros ligandos