Imaging Dpp Release da un disco ala Drosophila

Le proteine morfogenetiche ossee (BMP) sono essenziali per l’embriogenesi precoce e la modellazione di strutture adulte. I BMP sono prodotti e secreti per influenzare la trascrizione dei geni bersaglio necessari per la crescita e la differenziazione cellulare nelle cellule che rispondono. Decapentaplegic (Dpp) è un omologo di Drosophila di BMP4 che è importante per lo sviluppo di strutture embrionali e adulte come l’ala^1,2,3,4. Diversi gruppi si sono concentrati sul ruolo del Dpp nel patterning adult ole di mosca perché 1) le ali sono costituite da due fogli di epitelia trasparenti con un modello di venazione coerente che può essere facilmente valutato; 2) i dischi ali sono anche ragionevolmente piatti, possono essere coltivati al di fuori della larva e sono semplici da immaginare e quantificare le differenze di modello; e 3) lo sviluppo del modello alare è sensibile al Dpp in modo tale che piccole perturbazioni nel percorso avranno un impatto sul modello di venazione dell’ala.

Dpp è prodotto in celle situate nel contorno anteriore/posteriore del disco alare^5,6,7,8. Dpp si lega a un complesso di tipo 1 e tipo 2 serine / preonina recettori della chinasi^9,10. Al momento dell’attacco Dpp, il recettore di tipo 2 fa fosforolaili del recettore di tipo 1 che poi fa fosfolato Madri contro Dpp (Mad), un omologa Smad 1/5/8. Phosphorylated SMAD recluta un’ulteriore co-Smad (Medea), che le consente di entrare nel nucleo dove regola i geni bersaglio, portando a effetti a valle come la proliferazione o la differenziazione^4,11.

Recentemente, il Bates Lab ha dimostrato che il rilascio improprio di Dpp all’interno del disco alare può portare a una diminuzione del fosfororylazione pazza, alla riduzione dell’espressione genica bersaglio e ai difetti di patterning^12,13. Diversi canali ionici influenzano lo sviluppo dell’ala della Drosophila e delle strutture associate^14,15. Questi canali ionici potrebbero anche essere coinvolti nel rilascio di Dpp. Nel determinare il meccanismo di rilascio morfogeno, è importante che sia disponibile un metodo per visualizzare gli eventi di rilascio.

I dottori Aurelio Teleman e Stephen Cohen hanno creato una proteina di fusione Dpp-GFP che è in grado di salvare la perdita di Dpp, il che significa che è biologicamente attiva e viene rilasciata in modo biologicamente rilevante¹⁶. Qui, descriviamo come visualizziamo gli eventi di rilascio Dpp utilizzando questo Dpp-GFP. Questa proteina di fusione è particolarmente utile perché la GFP è sensibile al pH in modo tale che quando è in vescicoli acidi, la fluorescenza viene spenta¹⁷. Pertanto, quando una proteina etichettata con GFP viene rilasciata da una vescica nell’ambiente extracellulare più neutro, l’intensità della fluorescenza GFP aumenta^{di 17}. Abbiamo sfruttato la sensibilità al pH di GFP per determinare se Dpp-GFP risiede in vesciche acide. Abbiamo immaginato dischi alari che esprimono Dpp-GFP prima e dopo l’aggiunta di cloruro di ammonio, che neutralizza i compartimenti intracellulari vescicoli¹⁸. Abbiamo trovato un aumento significativo della fluorescenza della puncora dopo l’aggiunta di cloruro di ammonio, suggerendo che il Dpp-GFP intracellulare viene spento prima dell’aggiunta di cloruro di ammonio¹⁸. Concludiamo che il Dpp-GFP intracellulare risiede in compartimenti acidi legati alla membrana, come le vescicle, ed è invaloreso dopo l’aggiunta di cloruro di ammonio per neutralizzare il pH dei compartimenti intracellulari¹⁸. Questo rende l’imaging live di Dpp-GFP una tecnica utile per visualizzare la dinamica di Dpp nel disco alare della Drosophila quando viene rilasciato dai compartimenti acidi nell’ambiente extracellulare.

Qui descriviamo il metodo che usiamo per visualizzare gli eventi di rilascio Dpp utilizzando Dpp-GFP. Dpp-GFP può essere espresso nel suo modello nativo nei dischi alari della Drosophila utilizzando il sistema UAS-GAL4¹⁹. Questo è il metodo utilizzato per determinare che i canali Irk influiscono sulla versione¹⁸di Dpp. Abbiamo convalidato il metodo con z-stack di imaging live. Non vediamo Puncta Dpp-GFP muoversi all’interno del piano di messa a fuoco in serie temporali se abbiamo acquisito in un piano di messa a fuoco. Inoltre non vediamo il movimento di Puncta Dpp-GFP se abbiamo immagine in uno z-stack. Concludiamo che la puncta Dpp-GFP vista con questo metodo sono eventi di rilascio piuttosto che movimento di vescicoli intracellulare. Questo metodo di imaging live di Dpp-GFP potrebbe essere potenzialmente utilizzato per testare altri modificatori putatti del rilascio di Dpp per il loro impatto sulla dinamica Dpp o potrebbe essere modificato per esaminare le dinamiche di altri ligandi